MicroRNA-27a調(diào)控骨肉瘤生物學(xué)行為的機制研究.pdf

1、第一部分骨肉瘤細(xì)胞系miRNA表達譜的分析研究
　　目的：探索miRNA在不同骨肉瘤細(xì)胞系中的表達特征及差異，明確骨肉瘤細(xì)胞miRNA的共同表達譜，并為后續(xù)的機制研究提供方向指導(dǎo)。
　　方法：收集四種人骨肉瘤細(xì)胞系(U-2OS，Saos-2，MNNG/HOS，MG63)和人成骨細(xì)胞系（hFOB)，提取細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用miRNA表達譜芯片進行掃描篩查分析，建立骨肉瘤細(xì)胞系的miRNA表達譜。
　　結(jié)果：應(yīng)用 miR

2、NA表達譜芯片檢測四種人骨肉瘤細(xì)胞系(U-2OS，Saos-2，MNNG/HOS，MG63)和人成骨細(xì)胞系(hFOB)之間具有差異性表達特點的miRNA。我們發(fā)現(xiàn)：相對于人成骨細(xì)胞系，在四種人骨肉瘤細(xì)胞系中表達差異達2倍及以上的miRNA共有27個，其中表達水平上調(diào)的miRNA共有23個（let-7e-5p，miR-20b-5p，miR-92a-3p，miR-125a-5p，miR-196a-5p，miR-214-3p，miR-20a-

3、5p，miR-181a-5p，miR-29b-3p，miR-10b-5p，miR-301a-3p，miR-181d，miR-21-5p，miR-206，miR-7-5p，miR-29a-3p，miR-17-5p，miR-210，miR-25-3p，miR-18a-5p，miR-181c-5p，miR-32-5p，miR-27a-3p），表達水平下調(diào)的miRNA共有4個（miR-142-5p，miR-133b，miR-16，miR-144

4、-3p）。
　　結(jié)論：通過 miRNA表達譜芯片的檢測與篩選，我們發(fā)現(xiàn)與人成骨細(xì)胞系相對比，在四種人骨肉瘤細(xì)胞系(U-2OS，Saos-2，MNNG/HOS，MG63)共有27個miRNA呈差異性表達的特點。這些具有差異性表達的miRNA可以為進一步研究miRNA在骨肉瘤中的作用與功能提供一定的實驗基礎(chǔ)及方向指導(dǎo)。
　　第二部分miR-27a調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的機制研究
　　目的：觀察miR-27a對骨肉

5、瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲影響及其調(diào)控機制。
　　方法：利用Lipofectamine?2000將miR-27a inhibitor、miR-27a negative control、miR-27a mimics和miR-27a mimics control轉(zhuǎn)染于骨肉瘤細(xì)胞系。利用Caspase-3、8和9酶活性試劑盒檢測檢測Caspase-3、8和9酶活性，流式細(xì)胞檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，MTT實驗檢測對細(xì)胞增殖的影響，Transw

6、ell遷移與侵襲實驗評價細(xì)胞遷移侵襲能力，細(xì)胞克隆形成實驗評價骨肉瘤細(xì)胞克隆形成的能力，qRT-PCR和Western blot檢測骨肉瘤細(xì)胞PUMA、BAK和BAX表達情況。建立裸鼠皮下骨肉瘤瘤模型，繪制腫瘤生長曲線，測量腫瘤體積以及腫瘤重量，qRT-PCR和Western blotting檢測PUMA、BAK和BAX表達情況。結(jié)果：與其他組相比，miR-27a inhibitor組骨肉瘤細(xì)胞的Caspase-3、9酶活性顯著增加（P

7、<0.01），Caspase-8酶活性也有增加（與無轉(zhuǎn)染組對比P<0.05），細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P<0.01），增殖明顯受到抑制（P<0.01），遷移顯著減少（P<0.01），細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01），細(xì)胞的克隆形成數(shù)目顯著減少（P<0.01）。miR-27a的表達水平與PUMA蛋白表達呈顯著的負(fù)相關(guān)性，熒光素酶報告法證實PUMA基因的3’UTR可以被miR-27a結(jié)合。動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-27a inhibi