MicroRNA145對骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分MicroRNA-145和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在人骨肉瘤組織中的表達(dá)變化
　　目的:探討人骨肉瘤組織microRNA-145(miRNA-145)和VEGF表達(dá)的變化及其臨床意義。
　　方法:臨床上收集華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院28例人骨肉瘤標(biāo)本,用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測28例骨肉瘤標(biāo)本中骨肉瘤組織,腫瘤邊緣組織,正常組織中miRNA-145的表達(dá)變化;用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR以及免疫組織化學(xué)的方

2、法檢測28例骨肉瘤標(biāo)本中骨肉瘤組織,腫瘤邊緣組織,正常組織中VEGF的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:28例標(biāo)本中25例骨肉瘤組織中miRNA-145的表達(dá)較正常組織明顯降低,腫瘤邊緣組織中的表達(dá)位于兩者之間,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。28例標(biāo)本中所有骨肉瘤組織中VEGF的表達(dá)較正常組織中明顯增高,腫瘤邊緣組織中的表達(dá)位于兩者之間,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:骨肉瘤組織中的miRNA-145的表達(dá)下調(diào),VEGF的表達(dá)

3、上調(diào),miRNA-145和VEGF參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展,兩者之間可能存在著聯(lián)系。
　　第二部分MicroRNA-145對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究microRNA-145(miRNA-145)對于骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、粘附侵襲以及促血管形成能力的影響。
　　方法:用脂質(zhì)體法將miRNA-145模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)中,實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組、陰性對照

4、轉(zhuǎn)染組、miRNA-145轉(zhuǎn)染組三組,轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測各組細(xì)胞miRNA-145的表達(dá),蛋白質(zhì)印跡法WesternBlot檢測各組細(xì)胞VEGF的表達(dá),MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率,細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的粘附能力,Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲能力,小管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的促進(jìn)血管生成能力。
　　結(jié)果:MiRNA-14

5、5轉(zhuǎn)染組中miRNA-145的表達(dá)明顯增高,VEGF的表達(dá)明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);MiRNA-145轉(zhuǎn)染組中腫瘤細(xì)胞增殖速度明顯下降,細(xì)胞周期停止在G1期之前,凋亡率增高,細(xì)胞粘附力和侵襲力明顯降低,促進(jìn)血管生成能力明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:MiRNA-145可以有效的抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、粘附、侵襲和促血管形成能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,miRNA-145是一種骨肉瘤抑制基因,miRNA-145

6、和VEGF之間可能存在相關(guān)調(diào)控關(guān)系。
　　第三部分MicroRNA-145調(diào)控骨肉瘤中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討骨肉瘤中microRNA-145(miRNA-145)對于VEGF表達(dá)的相關(guān)調(diào)控關(guān)系。
　　方法:采用熒光素酶報(bào)告基因檢測方法,構(gòu)建含有VEGF-3’UTR的表達(dá)質(zhì)粒(包括野生型和突變體),將含有VEGF-3’UTR的質(zhì)粒與miRNA-145共轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)分為三組

7、:單純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,含有VEGF-3’UTR質(zhì)粒和miRNA-145陰性對照共轉(zhuǎn)染組,含有VEGF-3’UTR和miRNA-145共轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)監(jiān)測各組細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:含有VEGF-3’UTR的表達(dá)質(zhì)粒(野生型)與miRNA-145共轉(zhuǎn)染組熒光素酶的表達(dá)較其他兩組明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而含有VEGF-3’UTR突變體的表達(dá)質(zhì)粒與miRNA-145共轉(zhuǎn)染組熒光素酶的表達(dá)與其他兩組相比較無

8、明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論:MiRNA-145可以與VEGF的3’-UTR不完全互補(bǔ)結(jié)合,下調(diào)骨肉瘤中VEGF的表達(dá),VEGF是miRNA-145的一個(gè)靶基因。
　　第四部分MicroRNA-145對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究microRNA-145(miRNA-145)對于裸鼠體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞生長和微血管形成的影響。
　　方法:Balb/c裸小鼠16只,隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組

9、,每組8只,對照組用未轉(zhuǎn)染的MG63細(xì)胞建立骨肉瘤模型,實(shí)驗(yàn)組用轉(zhuǎn)染miRNA-145模擬物的MG63細(xì)胞建立骨肉瘤模型。荷瘤裸鼠飼養(yǎng)4周,比較兩組成瘤率,瘤體大小,瘤體重量,用免疫組織化學(xué)的檢測方法檢測兩組裸鼠瘤體VIII因子和VEGF的表達(dá),并計(jì)算微血管密度(MVD)。
　　結(jié)果:對照組裸鼠成瘤率87.5％,實(shí)驗(yàn)組裸鼠成瘤率37.5%,實(shí)驗(yàn)組裸鼠形成腫瘤大小,重量明顯低于對照組,實(shí)驗(yàn)組形成腫瘤VEGF的表達(dá)較對照組明顯降低,M