SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中的表達(dá).pdf

1、白內(nèi)障是世界的首要致盲性眼病，隨著人口年齡結(jié)構(gòu)的增長，白內(nèi)障成為老年人致盲的重要原因。統(tǒng)計資料表明老年性白內(nèi)障的發(fā)生率占老年性眼病的1/4。目前有效的治療方法為手術(shù)摘除混濁的晶狀體，盡管隨著手術(shù)技術(shù)、手術(shù)器械的不斷發(fā)展，白內(nèi)障手術(shù)變的越來越普遍，近年來仍有許多研究人員致力于白內(nèi)障病因?qū)W的基礎(chǔ)研究，且大量工作集中于發(fā)病機(jī)制及后發(fā)障的研究，故力圖從發(fā)病機(jī)制入手，有效的防治白內(nèi)障逐漸成為許多眼科工作者所熱衷的白內(nèi)障治療的新領(lǐng)域。在白內(nèi)障發(fā)病的

2、過程中，晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)起到了關(guān)鍵的作用，任何能夠影響其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能的因素都可能參與白內(nèi)障的形成過程。
　　 富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine，簡稱SPARC)是一種多細(xì)胞分泌的小分子蛋白。最早是由Termine等作為一種牛和入骨組織中的非膠原組分發(fā)現(xiàn)并描述的。近二十年來，根據(jù)不同的命名依據(jù)，SPARC又被稱作43K(依據(jù)蛋白的大小

3、)，BM(基底膜)-40(根據(jù)組織來源)，骨連接素(根據(jù)其與骨基質(zhì)具高親和力的生化特性)。SPARC屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族。SPARC基因顯示為單拷貝基因，人類的SPARC位于5q31-33。脊椎動物SPARC的cDNA編碼的蛋白含有298-304個氨基酸，是在一個含有77個氨基酸的信號肽序列后跟隨了一個含283-287個氨基酸殘基的隱匿部分。Engel等提出SPARC含有四個不同的區(qū)域。區(qū)域Ⅰ(氨基酸殘基3-51)，由外顯子3和4編碼

4、，富含酸性并有5-8個Ca++結(jié)合位點，但親和性相對較低，此區(qū)域的α雙螺旋結(jié)構(gòu)對Ca++濃度的生理性流出敏感。區(qū)域Ⅱ(氨基酸殘基52-132)，由外顯子5和6編碼，富含半胱氨酸，與folliststin的同源性很高，該區(qū)域尚有GHK序列及2個Cu++結(jié)合位點，參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。區(qū)域Ⅲ(氨基酸殘基133-227)外顯子7和8編碼，被認(rèn)為是α螺旋片段的延伸系列，并含有內(nèi)源性蛋白酶的酶切位點。位于此區(qū)域N端的Cys137以二硫鍵與區(qū)域Ⅳ的C

5、ys247結(jié)合。區(qū)域Ⅳ(氨基酸殘基228-285)，含有由外顯子9編碼的EF臂，具有高鈣親和力位點。SPARC的生物學(xué)特性如下：1、抗增殖和粘附作用：2、調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用；3、與細(xì)胞因子結(jié)合及相互作用；4、影響生物體的發(fā)育；5、影響損傷愈合及血管發(fā)生。
　　 近年來對SPARC的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域。SPARC對細(xì)胞有抗黏附、抑制增殖的作用，國內(nèi)外相關(guān)的研究多是集中于其對各種腫瘤細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、腎臟囊腫襯里上

6、皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等的抑制作用，尚無研究直接觀察外源性的SPARC對體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究采用多種方法觀察了SPARC對人晶狀體上皮細(xì)胞增殖、黏附、移行的影響，并檢測了外界的不同刺激對晶狀體上皮細(xì)胞中SPARC表達(dá)的影響，而后又對比了臨床上正常人及不同年齡組的白內(nèi)障患者的晶狀體上皮細(xì)胞中SPARC表達(dá)，探討其在白內(nèi)障中的表達(dá)與年齡的相關(guān)性，為研究白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制及后發(fā)障的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

7、>　　 實驗方法：
　　 一、SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞增殖、黏附、移行的影響
　　 1、人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04的培養(yǎng)：
　　 將SRA01/04用DMEM+10％胎牛血清接種于培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液，之后每2-3天更換一次培養(yǎng)液，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　 2、細(xì)胞增殖的

8、檢測：
　　 向制成的細(xì)胞懸液中加入不同濃度的SPARC(0、0.2、1、5ug/ml)，作用24、48、72小時后，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及增殖指數(shù)，RT-PCR檢測細(xì)胞周期調(diào)控基因CCND1、PCNA的表達(dá)。
　　 3、細(xì)胞黏附的檢測：
　　 將SRA01/04細(xì)胞傳代培養(yǎng)后制成密度為1×108個/L的細(xì)胞懸液，分別加入含0、0.2、1、5ug/ml SPARC，接種于涂有鼠尾蛋白的96

9、孔板中，培養(yǎng)后加入MTT，酶標(biāo)儀讀OD值，檢測細(xì)胞黏附的情況。將含有不同濃度SPARC的細(xì)胞懸液滴加到人工晶狀體表面，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化，并用血小板記數(shù)法記數(shù)人工晶狀體表面黏附的細(xì)胞數(shù)。
　　 4、細(xì)胞遷移的檢測：
　　 采用絲裂霉素劃痕法檢測SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞移行的影響。
　　 二、熱應(yīng)激及氧化損傷對晶狀體上皮細(xì)胞中SPARC表達(dá)的影響
　　 將永生化人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04傳代培

10、養(yǎng)后分為3組：(1)正常對照組；(2)氧化損傷組：細(xì)胞中加入200×106mol/LH2O2作用6h；(3)熱應(yīng)激處理組：42℃30min，37℃恢復(fù)2h。細(xì)胞免疫組化法檢測SPARC的表達(dá)，常規(guī)Westernblotting檢測SPARC的含量。GIS-700D型凝膠圖像系統(tǒng)掃描分析，記錄平均灰度值。
　　 三、SPARC在不同年齡組年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)
　　 對照組：角膜移植術(shù)供眼6例，于晶狀體

11、赤道部剪開前囊，取出囊膜，白內(nèi)障手術(shù)患者80例(分4組，<50歲組，50-65歲組，65-80歲組，>80歲組，每組20例)于超聲乳化手術(shù)中環(huán)行撕囊后取直徑約5mm的前囊，樣品采集后立即放入-80℃低溫冰箱中保存，實驗前按年齡相近、性別相同的原則將4例囊膜合并成1例樣本，合并后為20例。免疫印跡(Western blotting)法檢測SPARC蛋白含量，GIS-700D型凝膠圖像系統(tǒng)掃描分析，記錄平均灰度值。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理

12、：本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5 for windoiws軟件包進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞增殖、黏附、移行的影響
　　 (一)SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞增殖的影響
　　 1、MTT法檢測細(xì)胞增殖
　　 結(jié)果顯示0.2ug/mlSPARC有抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05

13、)，而1ug/mlSPARC則可以明確抑制其增殖(P<0.05)，5ug/mlSPARC的抑制作用則更加顯著(P<0.01)。隨著作用時間的延長，抑制作用也逐漸增強(qiáng)。不同濃度SPARC作用72h對晶狀體上皮細(xì)胞均有抑制，但0.2ug/ml組無統(tǒng)計學(xué)意義。5ug/mlSPARC作用72h的抑制率達(dá)68%。
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及增殖指數(shù)
　　 隨著SPARC濃度的增加，S+G2/M期細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞停滯于G0

14、/G1期，增殖指數(shù)逐漸下降，當(dāng)SPARC濃度達(dá)5ug/ml，增殖指數(shù)下降至32.6%。
　　 3、RT-PCR檢測細(xì)胞周期調(diào)控基因CCND1、PCNA的表達(dá)
　　 結(jié)果示微克級水平的SPARC能使細(xì)胞停滯在G0/G1期。5ug/mlSPARC作用于晶狀體上皮細(xì)胞72h后，CCND1mRNA水平較對照組顯著減弱，PCNAmRNA水平較對照組顯著增強(qiáng)。
　　 (二)SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞黏附的影響
　　

15、1、SPARC與鼠尾蛋白的黏附檢測
　　 MTT法顯示微克水平的SPARC可以明確抑制晶狀體上皮細(xì)胞與膠原的黏附，并與濃度成正相關(guān)(P<0.05)。
　　 2、SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞在人工晶狀體表面黏附的影響
　　 倒置顯微鏡下可見相對于對照組，實驗組黏附于人工晶狀體表面的細(xì)胞隨著SPARC濃度的增加、作用時間的延長而逐漸稀疏、數(shù)目減少。血小板記數(shù)法記數(shù)人工晶狀體表面黏附的細(xì)胞數(shù)結(jié)果顯示0.2 ug/mlSP

16、ARC有抑制黏附的趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；1ug/ml組即可見明確的抑制作用(P<0.01)；5ug/ml組作用更加明顯(P=0.00)。作用1d時0.2ug/ml組未見明確改變(P>0.05)，余2組均可見細(xì)胞減少，3d、7d時各組均可見明確的抑制作用(P<0.01)。
　　 (三)SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞移行的影響
　　 培養(yǎng)72h微克水平的SPARC可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞移行，5ug/mlSPAR

17、C則有更明顯的抑制作用(P<0.01)。
　　 二、熱應(yīng)激及氧化損傷對晶狀體上皮細(xì)胞中SPARC表達(dá)的影響
　　 1、細(xì)胞免疫組化檢測SPARC表達(dá)
　　 正常對照組未見明確的熒光，熱應(yīng)激、氧化損傷組均可見明確的熒光反應(yīng)。
　　 2、免疫印記(Western blotting)法檢測SPARC蛋白含量
　　 對照組43Kd處未見明確條帶，氧化損傷組、熱應(yīng)激處理組均可見SPARC表達(dá)上調(diào)。
　

18、　 三、SPARC在不同年齡組年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)
　　 Western blotting結(jié)果顯示，對照組(即正常人)43Kd處未見明確條帶，實驗4組均可見有明確的SPARC表達(dá)(P均<0.05)，并可見隨著年齡的增長，SPARC表達(dá)增強(qiáng)。實驗4組中，80歲以上組較其它3組SPARC表達(dá)明顯增高(P均<0.01)，65-80歲組較65歲以下2組SPARC表達(dá)增高(P均<0.01)，50-65歲組較50歲組

19、表達(dá)有增高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.055)。
　　 結(jié)論：
　　 1、微克水平的外源性SPARC對晶狀體上皮細(xì)胞增殖、黏附、移行具有明確的抑制作用。SPARC能夠抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，增殖指數(shù)下降，并使細(xì)胞周期調(diào)控基因CCND1mRNA表達(dá)減弱，PCNAmRNA表達(dá)增強(qiáng)。
　　 2、外源性SPARC能夠抑制晶狀體上皮細(xì)胞在人工晶狀體表面的黏附，抑制作用隨濃度的增加及作用時間延長