MicroRNa-34a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的表達改變及其對人晶狀體上皮細胞凋亡作用的機制研究.pdf

1、引言：年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是全球致盲眼病的主要原因，手術(shù)仍是目前唯一的治療途徑，隨著當(dāng)今社會老齡化的進展，白內(nèi)障手術(shù)需求量將逐年增加，給國民帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。因此深入研究ARC的根本發(fā)病機制，以期找到早期有效的干預(yù)措施，具有重要意義。機體衰老是個復(fù)雜的過程，也是生命科學(xué)領(lǐng)域一直以來想要攻克的難題，其中包括晶狀體的老化，即白內(nèi)障形成，也是機體內(nèi)外各種環(huán)境、代謝因素參與致病的結(jié)果。已有研究證明表觀遺傳調(diào)控與環(huán)境危險因素和其他調(diào)節(jié)因

2、素存在密切聯(lián)系，因此推測其在ARC復(fù)雜的發(fā)病機制中起著重要的作用。表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因表達的機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾及微小RNA(microRNA)，是不涉及DNA序列改變的基因組修飾作用。其中microRNA是一組單鏈、內(nèi)源性的非編碼小RNA，通常與靶基因序列3'UTR特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達，參與調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育、分化、增殖、凋亡、應(yīng)激及衰老等生物學(xué)進程。往年microRNA一直是腫瘤、血液中的研究熱點之一，

3、而其在眼部疾病中的作用卻較少引起學(xué)者關(guān)注，近年來microRNA在眼科疾病中的研究也已初步展開。首次報道顯示microRNA的表達譜在人透明晶狀體上皮與白內(nèi)障晶狀體上皮中有顯著差異，這提示microRNA的異常表達在晶狀體發(fā)育、白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，本文將著重研究microRNA參與ARC發(fā)病機制的具體分子機制，在體內(nèi)篩選、驗證microRNA在ARC中表達的改變，在體外探究microRNA誘導(dǎo)人品狀體

4、上皮細胞功能學(xué)改變的具體分子機制，并試圖探索在ARC中異常表達的microRNA啟動子DNA甲基化是否參與調(diào)控，是否共同相互作用參與ARC的發(fā)病機制。
　　第一部分 MicroRNA-34a在ARC的表達及其啟動子甲基化水平
　　目的：探討microRNA-34a(miR-34a)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)中的表達及其啟動子甲基化程度改變。
　　方法：收集ARC晶狀體前囊膜30例，透明晶狀體前囊膜18例，采用RT-P

5、CR檢測miR-34a和miR-933的表達水平，并評價其表達在兩組間的差異;選擇在ARC組較對照組表達差異最顯著的miR-34a為研究對象，在12例ARC前囊膜及8例透明對照前囊膜組織進行焦磷酸鹽測序，檢測miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化程度。
　　結(jié)果：miR-34a在白內(nèi)障組表達高于透明晶狀體組，miR-933的表達水平未見明顯差異;其啟動子甲基化程度在兩組間無顯著差異。
　　結(jié)論：miR-34a在ARC前囊膜表達升

6、高，可能參與了ARC發(fā)病。
　　第二部分MicroRNA-34a調(diào)控人晶狀體上皮細胞凋亡相關(guān)功能研究
　　目的:研究miR-34a對HLECs凋亡的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞系SRA01/04，將miR-34a雙鏈模擬物(miR-34a mimics)和陰性對照模擬物(negative mimics)分別轉(zhuǎn)染至人晶狀體上皮細胞系。轉(zhuǎn)染后24至72小時，流式細胞儀分析miR-34a轉(zhuǎn)染后細胞凋亡的改變，并

7、檢測caspase3/7活性;Western Blot尋找上游激活靶蛋白;熒光顯微鏡觀察JC-1染色后線粒體內(nèi)膜電位改變，WB檢測細胞質(zhì)及線粒體細胞色素C(Cyto C)含量評價線粒體外膜功能;提取細胞總RNA，分析線粒體呼吸鏈上相關(guān)功能基因的表達;DCFH-DA探針法檢測細胞內(nèi)活性氧積聚程度。
　　結(jié)果:miR-34a mimics轉(zhuǎn)染48小時后SRA01/04發(fā)生早期及晚期凋亡的比例較對照組增加，活化的caspase3/7表達

8、升高。JC-1染色提示miR-34a過表達導(dǎo)致晶狀體上皮細胞線粒體內(nèi)膜電位下降，WB顯示Cyto C的含量在胞漿中顯著大于線粒體內(nèi)，說明線粒體外膜通透性增加、功能受損;同時線粒體呼吸鏈上相關(guān)基因NDUFS8、COX5b和ATP5a1表達明顯下降，提示線粒體呼吸鏈電子傳遞功能受損;DCFH探針熒光在miR-34a組顯著高于對照組，提示miR-34a過表達導(dǎo)致自由基產(chǎn)生，使胞內(nèi)活性氧基團（ROS）蓄積誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　結(jié)論:晶狀

9、體上皮細胞中miR-34a過表達可通過損傷線粒體功能而導(dǎo)致細胞凋亡。
　　第三部分 MicroRNA-34a調(diào)控人晶狀體上皮細胞凋亡的機制研究
　　目的:研究miR-34a在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控人晶狀體上皮細胞凋亡的具體機制。
　　方法:聯(lián)合利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站(Pictar、TargetScan、MiRanda)篩選miR-34a的候選靶基因，絕對定量PCR驗證晶狀體上皮細胞中候選靶基因的表達，在轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物與

10、陰性對照模擬物的SRA01/04中利用相對定量PCR和WB檢測靶基因表達;構(gòu)建miR-34a與靶基因3'UTR互補結(jié)合的質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染至HEK293-T細胞，并用雙熒光素酶報告基因分析在轉(zhuǎn)錄水平進行靶基因驗證。確定靶基因后，轉(zhuǎn)染靶基因的si-RNA以實現(xiàn)靶基因敲減，再次利用流式細胞、caspase3/7活性與caspase9的WB評價細胞凋亡及線粒體功能的改變。
　　結(jié)果:篩選出靶基因Notch1、Notch2、Jag1、Jag2均

11、位于Notch通路并在晶狀體上皮中表達，Notch1及Notch2是此通路中關(guān)鍵的受體蛋白基因，PCR及WB顯示在轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物的晶狀體上皮細胞中Notch1及Notch2的表達較對照組受到抑制;雙熒光素酶報告基因分析顯示Notch1和Notch2的3'UTR螢火蟲活性在miR-34a過表達組顯著抑制，而突變型質(zhì)粒則對miR-34a過表達及陰性對照組間螢火蟲熒光活性無明顯改變，由此確定miR-34可直接與Notch1、Notc

12、h2的3'UTR結(jié)合抑制其表達。進而在晶狀體上皮細胞中將Notch1及Notch2基因敲減，進行流式凋亡功能檢測及caspase3/7活性檢測，發(fā)現(xiàn)Notch1敲減組細胞凋亡及caspase3/7活性增加不顯著，而Notch2敲減組細胞早期及晚期凋亡顯著增加，caspase3/7活性也較對照組顯著升高。并且在Notch2敲減組的晶狀體上皮細胞中線粒體凋亡標(biāo)志蛋白caspase9的表達顯著升高。
　　結(jié)論:miR-34a通過抑制靶基