年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體蛋白磷酸化位點(diǎn)鑒定.pdf

1、白內(nèi)障是全球首位致盲眼病，而年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age related cataract，ARC)也是老年人視力下降的主要原因。目前手術(shù)仍是治療白內(nèi)障唯一有效的方法，由于我國(guó)人口數(shù)量龐大，經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)，高昂的手術(shù)費(fèi)用會(huì)給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，預(yù)防或者推遲ARC發(fā)病，無(wú)疑具有重要意義。
　　 磷酸化是一種常見(jiàn)蛋白質(zhì)翻譯后修飾，磷酸化與去磷酸化這一可逆的過(guò)程調(diào)節(jié)著信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)等多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，而蛋白質(zhì)磷酸化修飾的異常會(huì)

2、引發(fā)一系列疾病。晶狀體蛋白是人晶狀體內(nèi)含量最高的結(jié)構(gòu)與功能蛋白，研究者推測(cè)晶狀體蛋白的磷酸化與去磷酸化的過(guò)程失調(diào)可能是ARC發(fā)病的早期改變或者說(shuō)是晶狀體蛋白變性前的病變。
　　 由于晶狀體蛋白磷酸化過(guò)程是可逆的，因此在晶狀體蛋白尚未發(fā)生變性的早期，也即白內(nèi)障形成之前是干預(yù)ARC發(fā)病的有效時(shí)機(jī)。鑒定晶狀體蛋白的磷酸化位點(diǎn)，將是進(jìn)一步探索位點(diǎn)功能的第一步。
　　 本實(shí)驗(yàn)首次利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人透明晶

3、狀體與ARC晶狀體組織切片中的磷酸化位點(diǎn)。研究者在人透明晶狀體中鑒定到了4種晶狀體蛋白中的8個(gè)磷酸化位點(diǎn)；在ARC晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中9個(gè)磷酸化位點(diǎn)先前未有報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步的磷酸化位點(diǎn)質(zhì)譜成像定位和磷酸化位點(diǎn)的功能學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第一部分
　　 晶狀體冰凍切片及質(zhì)譜鑒定條件的優(yōu)化
　　 目的：探求人晶狀體組織冰凍切片的最佳條件并優(yōu)化基質(zhì)輔助激光解析

4、電離質(zhì)譜對(duì)晶狀體組織切片鑒定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。
　　 方法：(1)將-80℃凍存的人透明晶狀體與ARC晶狀體分別在-10℃至-25℃溫度下沿赤道部軸向切片，切片厚度10μm至20μm，用解剖鏡觀察所得切片，確定最適宜的溫度與切片厚度。
　　 (2)使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白細(xì)胞色素C與馬心肌紅蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，從基質(zhì)種類(lèi)、基質(zhì)噴涂層數(shù)、噴涂速度等各方面優(yōu)化并探尋最佳的基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定晶狀體組織切片中磷酸化位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

5、　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)解剖鏡觀察，最適宜的切片溫度為-18℃，切片厚度為14μm。此條件下切片完整性好，易于轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定?；|(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人晶狀體組織切片的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：以加入0.1％三氟乙酸、0.6-0.8mg/ml檸檬酸氨的濃度為2.5mg/mL的α-氰基-4-羥基-肉桂酸(50％乙腈：50％水)為基質(zhì)，直接噴涂在組織切片表面；加熱溫度120℃，基質(zhì)流速0.100ml/min，噴頭移動(dòng)速度200mm/min，晾干

6、后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用DataExPlorer4.5進(jìn)行后期處理。
　　 結(jié)論：確立了人晶狀體組織冰凍切片的最佳條件，并優(yōu)化了基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜對(duì)人晶狀體組織切片鑒定的實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)參數(shù)，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分
　　 原位酶解結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜鑒定晶狀體蛋白磷酸化位點(diǎn)
　　 目的：在優(yōu)化了的實(shí)驗(yàn)條件下，利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定年齡相關(guān)性白內(nèi)

7、障晶狀體及人透明晶狀體中晶狀體蛋白的磷酸化位點(diǎn)并比較其差異。
　　 方法：(1)將-80℃凍存的人透明晶狀體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體在-18℃溫度下沿赤道部軸向切片，切片厚度14μm，隨后將組織切片轉(zhuǎn)移至蓋玻片上。
　　 (2)用肌紅蛋白、牛血清白蛋和α-酪蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反應(yīng)器的酶解效率進(jìn)行考察。
　　 (3)利用胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反應(yīng)器聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜鑒定人透明晶狀

8、體與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織切片中的磷酸化位點(diǎn)，所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用DataExPlorer4.5進(jìn)行后期處理。
　　 結(jié)果：研究者在人透明晶狀體中鑒定到了4種晶狀體蛋白中的8個(gè)磷酸化位點(diǎn)；在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中9個(gè)磷酸化位點(diǎn)先前未有報(bào)道。
　　 結(jié)論：首次利用原位酶解聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體中鑒定到了6種晶狀體蛋白中的11個(gè)磷酸化位點(diǎn)，為進(jìn)一