臍帶間充質干細胞的生物學特性、向神經樣細胞的分化及細胞移植治療顱腦損傷的研究.pdf

1、第一部分人臍帶間充質干細胞分離純化及基本生物學特性研究 目的：探討從人臍帶組織分離、培養(yǎng)間充質干細胞(MSC)的方法，并對獲取的MSC進行擴增、純化，研究其基本生物學特性。 方法：無菌條件下收集剖宮產新生兒臍帶，以20ml注射器分別插入兩根臍靜脈及一跟臍動脈內，反復沖洗，沖去血管內的殘存積血。組織剪將臍帶剪碎，直至1mm3大小組織塊。直接將組織塊接種于含DMEM/F12培養(yǎng)基或將組織塊經酶消化法獲取單個核細胞后接種于DM

2、EM/F12培養(yǎng)基。進行原代培養(yǎng)，觀察并記錄其形態(tài)學變化。細胞達到融合狀態(tài)時，消化傳代進行純化和擴增培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測MSC的細胞表面標志。繪制細胞生長曲線，通過5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)摻入實驗檢測其增殖能力。流式細胞儀測定細胞周期。RT-PCR檢測OCT-4mRNA表達。透射電鏡觀察臍帶MSC的形態(tài)和超微結構。 結果：兩種分離方法均可獲得成纖維樣細胞。組織塊貼壁法1周后于組織塊間隙已可見散在分布的長條索狀紡錘型細胞

3、，3周左右細胞達到80％融合。膠原酶消化法，細胞接種后第2天即可見有少量形態(tài)各異的貼壁細胞，散在分布，1周左右時，貼壁細胞形成集落，占優(yōu)勢的是成纖維樣細胞，及少量鵝卵石樣細胞，至2周左右可達到80％融合。經傳代培養(yǎng)后，可得到較為純化的成纖維樣細胞，細胞約每3天即可達到90％～95％融合，需再次傳代或凍存，細胞可傳代20代以上。分別對第3代、第5代、第10代臍帶MSC行FACS檢測，結果表明各代間免疫表型無明顯差異，均強烈表達CD13、C

4、D29、CD105、CD44，弱表達CD106，不表達CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45。對第2、6、12代UCMSCs生長曲線進行分析，表明其倍增時間分別為33.1h、34.4h、34.65h。BrdU摻入實驗中，培養(yǎng)液中加入BrdU后48小時，免疫組織化學染色顯示80％～90％細胞BrdU表達陽性。流式細胞儀進行細胞周期檢測表明，UCMSCs有80％～90％細胞處于G0-G1期。RT-PCR檢測示臍帶MSCOCT-4

5、mRNA表達陽性。透射電鏡觀察顯示臍帶MSC核大，不規(guī)則，核仁明顯，常染色質多，異染色質少；胞漿少，內有少量細胞器，以粗面內質網和線粒體為主，胞漿內有較多游離核糖體。 結論：組織快貼壁法和膠原酶消化法均可從臍帶組織提取到成纖維樣細胞。該細胞具有較強的增殖能力，且具有不成熟的細胞核及胞漿內的超微結構，OCT-4表達陽性，顯示其具有干細胞特性。細胞表面分子檢測顯示該臍帶來源干細胞表面抗原標志與骨髓MSC相同，是間充質干細胞的新成員。

6、作為從分娩廢棄物臍帶組織中提取到的干細胞，UCMSCs無倫理學限制，取材方便，為干細胞的研究及臨床應用鋪平了道路。 第二部分人臍帶間充質干細胞向神經元樣細胞定向誘導分化的研究 目的：探討人臍帶間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSC)向神經元樣細胞定向誘導分化的條件及方法，以明確其神經分化潛能，進而為臍帶MSC的神經移植提供理論依據。 方法：取第3，5，10代的MSC分別用三種不同的誘導方法

7、向神經元樣細胞誘導?；瘜W試劑誘導法首先將細胞置于預誘導液DMEM/F12+20％FBS+10ng/mlbFGF進行培養(yǎng)，24小時后去掉預誘導液，更換為誘導液(DMEM/F12+2％DMSO+200μMBHA+25μMKCL+2mM丙戊酸+10μM拂司扣林+1μM氫化可的松)，誘導5小時。丹參誘導法用同樣方法預誘導24小時后，更換為DMEM/F12+2％丹參注射液繼續(xù)誘導5小時。神經營養(yǎng)因子誘導法于培養(yǎng)基中添加bFGF(20ng/ml)，

8、EGF(20ng/ml)，全反式維甲酸(RA,0.5μM)，在37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內連續(xù)培養(yǎng)7天。誘導期間觀察細胞形態(tài)變化，誘導結束后，4％多聚甲醛固定細胞，分別用免疫組織化學法和免疫熒光法檢測神經元樣細胞特異性標志物Nestin，NSE，NeuN，NF-M，β-tubulinⅢ，GFAP表達。比較不同代數UCMSCs神經分化能力的差異。用RT-PCR法檢測神經營養(yǎng)因子誘導前后UCMSCs表達NSE、GFAPmRNA的差異。 結

9、果：化學誘導組加入誘導劑后0.5-1小時，UCMSCs即已出現形態(tài)變化，隨誘導時間延長，細胞形態(tài)變化愈加明顯，胞體伸出長長的突起，表現為神經細胞樣改變。多個細胞的突起有時相互連接形成網狀，類似樹突樣結構。然而8-10小時后，部分細胞死亡，胞體漂浮。丹參誘導組加入丹參注射液后，部分細胞胞漿收縮，伸出突起，表現為神經元樣細胞形態(tài)，但細胞形態(tài)變化緩和，不如化學誘導組明顯。神經營養(yǎng)因子誘導組，隨時間延長，胞體漸拉長，有部分細胞逐漸形成絲狀突起，

10、細胞生長狀態(tài)良好，無明顯細胞漂浮或死亡現象。免疫組化法檢測顯示不同代數的UCMSCs經化學試劑誘導后均表達Nestin，NSE，NeuN，NF-M，不表達GFAP。免疫熒光檢測顯示不同代數的UCMSCs經丹參誘導后均表達Nestin，NSE，NF-M，β-tubulinⅢ，并有少量細胞表達GFAP。神經營養(yǎng)因子誘導組同樣顯示大量細胞Nestin，NSE，NF-M，β-tubulinⅢ表達陽性，并有少量細胞表達GFAP。RT-PCR顯示神

11、經營養(yǎng)因子誘導前后NSEmRNA均有表達，但誘導后表達增加。GFAP則無論在誘導前后均未見表達。OCT-4mRNA表達在誘導后消失。 結論：UCMSCs經化學誘導法、中藥誘導法、神經營養(yǎng)因子誘導法均可分化為神經樣細胞，并表達神經細胞特異性標記物。表明UCMSCs具有神經分化潛能。本研究為UCMSCs神經移植治療神經系統(tǒng)疾病鋪平了道路。 第三部分人臍帶間質干細胞腦內移植治療大鼠液壓沖擊腦損傷的實驗研究 目的：觀察人

12、UCMSCs移植到正常大鼠腦組織移植后的存活、遷移及分化情況，并探討人UCMSCs腦內移植對大鼠液壓沖擊腦損傷的治療作用及其機制。 方法：1、取生長狀況良好貼壁培養(yǎng)第6代以內的人UCMSCs，分別用5-溴脫氧鳥嘧啶核苷(BrdU)或bis-benzimide(Hoechst33258)標記細胞。 2、微量注射泵以1μl/min的速度向正常大鼠海馬CA1段注入10μl標記的人UCMSCs細胞懸液(1×106個，D/F12混

13、懸)，細胞移植結束后根據動物不同分組分別于移植后1周、2周、4周、6周時處死動物，4％多聚甲醛灌注取材。于注射點部位冠狀切開，連續(xù)切片觀察移植細胞在腦組織內的分布。行免疫組織化學檢測移植細胞NSE，GFAP，NF-M的表達情況。 3、制作大鼠液壓沖擊腦損傷模型。傷后24小時，向損傷灶周邊立體定向注入10ulBrdU標記的UCMSCs細胞懸液(1×106個，D/F12混懸)，并設對照。分別于顱腦損傷前、傷后24小時、傷后48小時、

14、傷后1周、2周、3周、4周對動物進行神經運動功能進行評分。顱腦損傷后4周，處死動物并取材，于細胞移植位點連續(xù)冠狀切片，行BrdU免疫組織化學染色，并取BrdU陽性細胞相鄰切片分別行免疫組織化學染色觀察移植細胞NSE、GFAP的表達，細胞移植區(qū)域VEGF的表達。行Fitc-Bandeiraeasimplicifolialectin-1(Fitc-BSlectin-1)染色觀察損傷區(qū)微血管數量的變化。行TUNEL法原位標記損傷區(qū)域凋亡細胞。

15、 結果：1、正常大鼠海馬C1段移植UCMSC后，移植細胞至少可存活6周以上，向注射點臨近腦組織移行超過1mm，并向遠隔部位如室管膜下區(qū)遷移；免疫組織化學檢測表明部分移植細胞表達NSE、NF、GFAP。 2、大鼠液壓沖擊腦損傷后1-3周，TBI+UCMSCs移植組神經運動功功能評分顯著高于TBI+DF組、TBI組(p＜0.05)，損傷后4周，各組神經運動功較能評分均回復正常，組間無明顯差別(F=1.3，p＞0.1)。

16、 3、免疫組織化學檢查顯示部分移植細胞分別表達NSE、NF、GFAP。UCMSC移植組創(chuàng)傷區(qū)VEGF表達較對照組明顯增多。Fitc-BSlectin-1染色示UCMSC移植組創(chuàng)傷區(qū)皮層微血管密度明顯高于對照組。原位調亡染色顯示UCMSC移植組凋亡細胞數明顯少于對照組。 結論：人UCMSC大鼠腦組織內移植后可長期存活，向室管膜下區(qū)遷移并有部分細胞轉化為神經元。臍帶間質干細胞腦內移植有助于促進創(chuàng)傷性腦損傷后的早期功能恢復，這種治療