臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成肝樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:通過分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)，采用系列細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，探索高效可靠的體外誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞的技術(shù)方法。
　　 方法:采用健康產(chǎn)婦臍帶，用酶消化法分離、培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞抗原CD13、CD44、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)情況，鑒定分離的細(xì)胞是否為UCMSCs;用肝細(xì)胞生長因子(

2、hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-4(Fibroblast growth factor-4FGF-4)及白細(xì)胞介素6（Interleukin-6 IL-6）進(jìn)行組合分組:A組:僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基，即為陰性對照組;B組:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HGF+FGF-4;C組:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HGF+IL-6;D組:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HGF+FGF-4+IL-6誘導(dǎo)培養(yǎng)第3代(P3)的臍帶MSCs，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞標(biāo)志物

3、AFP、ALB的表達(dá)情況，比較各個(gè)誘導(dǎo)組誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞的細(xì)胞比例。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行分析，用單因素方差分析對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.UCMSC的細(xì)胞形態(tài)接種的UCMSC多于48小時(shí)后貼壁，5天后有短梭形細(xì)胞長出，后漸由短梭形變?yōu)榧?xì)長扁平的長梭形，15天后出現(xiàn)梭形細(xì)胞集落，呈漩渦狀或長條形生長，1月后細(xì)胞相互接觸，并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿底部。
　

4、　 2.UCMSC鑒定取培養(yǎng)至第三代(P3)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)，反映間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原CD13、CD44、CD105表達(dá)陽性，表達(dá)率分別為99.0％、98.4％、98.4％，而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)陰性，表達(dá)率分別為4.6％、9.48％、5.04％。
　　 3.UCMSC的誘導(dǎo)分化
　　 3.1誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)取培養(yǎng)至第三代的UCMSCs加入各細(xì)

5、胞因子組合向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)，經(jīng)3～4周呈放射狀的細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)逐步消失，長梭形細(xì)胞變類圓形或多角形，存在離散現(xiàn)象，胞漿出現(xiàn)顆粒，部分出現(xiàn)雙核。
　　 3.2肝樣細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)對誘導(dǎo)出的肝樣細(xì)胞行其標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(ALB)檢測顯示:A組始終沒有見到肝樣細(xì)胞的標(biāo)志物白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)的表達(dá)。而B、C、D組可以檢測到肝細(xì)胞的標(biāo)志物AFP、ALB的表達(dá)，AFP在誘導(dǎo)7天時(shí)，不同誘導(dǎo)組(B、C、D)比較，D

6、組表達(dá)率最高;至15天時(shí)各組表達(dá)均減少，但D組仍最高;至誘導(dǎo)20天時(shí)各組表達(dá)均消失。而ALB在誘導(dǎo)7天、15天、20天都有強(qiáng)表達(dá)。在誘導(dǎo)第7天，B組表達(dá)率最高;誘導(dǎo)15天、20天，B、D組表達(dá)率高于C組。
　　 結(jié)論:
　　 1.使用酶消化法可以從人臍帶中成功分離、培養(yǎng)出UCMSC。
　　 2.應(yīng)用肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-4(Fibrobla