人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的體外研究.pdf

1、目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法，研究其基本生物學(xué)特性。初步探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法。 方法：無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，利用PBS沖洗臍動脈及臍靜脈，將血液沖洗盡，將其剪碎至1mm3后，加入IV型膠原酶(0.1％)消化60min，然后加入胰酶(0.125％)消化30min，利用濾網(wǎng)過濾后收集細(xì)胞，DMEM(5％FBS)重懸細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80-90％融合后進(jìn)行1

2、:3傳代培養(yǎng)，取傳代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞儀檢測、生長活性、細(xì)胞周期分析、染色體數(shù)目分析及軟瓊脂克隆形成實驗。進(jìn)一步取第6代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種于12孔板中，待細(xì)胞生長至約70％融合后，利用兩步誘導(dǎo)法進(jìn)行誘導(dǎo)，對照組用原培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導(dǎo)組中加入0.5μM/L地塞米松，50g/LITS，20μg/LHGF，10μg/LFGF4，煙堿0.61g/L，共10天。后期加入20μg/LOSM，0.5μM/L地塞米松，5

3、0g/LITS。每3d換液1次，在不同誘導(dǎo)階段收集細(xì)胞后觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)，RT-PCR，糖原染色。 結(jié)果：利用膠原酶及胰酶兩步消化法能充分消化臍帶，細(xì)胞易于獲得，收集細(xì)胞后進(jìn)行原代培養(yǎng)，24小時可觀察到貼壁細(xì)胞，待生長至10天時可見細(xì)胞長滿瓶底，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每周傳代1次。觀察細(xì)胞形態(tài)為長梭形，不規(guī)則形，細(xì)胞大小不一，類似成纖維細(xì)胞，呈漩渦樣生長。取第6-9代細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CD105、Vime

4、ntin，基本不表達(dá)CD34、CD31、CD133。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)CD29、CD49、CD105，基本不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34。MTT實驗顯示細(xì)胞倍增時間為22h。細(xì)胞周期分析表明75％-85％細(xì)胞處于G0/G1。染色體分析可見細(xì)胞染色體條數(shù)正常。在軟瓊脂中無克隆形成。經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第14d可見細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化，細(xì)胞長突起逐漸消失，逐漸轉(zhuǎn)為圓形或卵圓形，經(jīng)免疫組化檢測可見細(xì)胞在第1周開始表達(dá)AFP，第2周時CK18、CK

5、19、OV6的表達(dá)被觀察到。在誘導(dǎo)第3周時ALB表達(dá)被觀察到，AFP表達(dá)逐漸減弱。到第4周AFP的表達(dá)基本消失，ALB的表達(dá)增強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞于第1周開始表達(dá)AFP，至誘導(dǎo)后期，AFP表達(dá)水平逐漸降低。于第3周時觀察到ALB表達(dá)，隨時間延長ALB表達(dá)逐漸增強(qiáng)。于第4周糖原染色呈陽性結(jié)果。 結(jié)論：經(jīng)酶消化法可從臍帶中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，易于獲得，體外增殖能力強(qiáng)，與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型相一致，符合間充質(zhì)干細(xì)胞基本