體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)一、細(xì)胞接種密度對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響 目的：采用纖維蛋白凝膠為載體支架，研究細(xì)胞接種密度對(duì)纖維蛋白凝膠中的軟骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成以及纖維蛋白凝膠體積變化的影響；探討體外構(gòu)建組織工程軟骨的最佳接種細(xì)胞密度。 方法：體外分離培養(yǎng)3周齡兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，將第3代軟骨細(xì)胞與纖維蛋白混合形成軟骨細(xì)胞終濃度為：1×106/ml(A組)、10×106/ml(B組)、50×106/ml(C組)的細(xì)胞凝膠復(fù)合物。動(dòng)

2、態(tài)觀察和測(cè)定復(fù)合物大體形態(tài)變化；采用組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色和掃描電鏡動(dòng)態(tài)觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)以及其中的細(xì)胞密度、硫酸糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)、Ⅱ型膠原等成分變化情況；應(yīng)用DMMB分光法測(cè)定組織工程軟骨和正常成熟軟骨組織的GAG含量；應(yīng)用胰蛋白酶和膠原酶消化組織分離出軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)軟骨細(xì)胞數(shù)量，了解軟骨細(xì)胞增殖率。 結(jié)果：在細(xì)胞-凝膠復(fù)合物的制備過(guò)程中，軟骨細(xì)胞與纖維蛋白凝膠能夠比較均勻地混合，并

3、固化成一定的外形，細(xì)胞無(wú)損傷，凝膠塊浸泡于培養(yǎng)液中不發(fā)生熔融或崩解。體外培養(yǎng)3周期間內(nèi)，A組和B組細(xì)胞-凝膠塊內(nèi)的軟骨細(xì)胞數(shù)量均逐漸增加，到3周時(shí)達(dá)到高峰(A組細(xì)胞-凝膠塊內(nèi)的軟骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最初接種細(xì)胞數(shù)量的4.532倍，B組達(dá)到最初接種細(xì)胞數(shù)量的2.097倍)。C組細(xì)胞-凝膠塊內(nèi)的軟骨細(xì)胞數(shù)量在3天時(shí)達(dá)到高峰(增殖倍數(shù)為1.147)，以后逐漸減少，到3周時(shí)最低(增殖倍數(shù)為0.907)。體外培養(yǎng)期間，C組細(xì)胞凝膠塊中的GAG和Ⅱ型膠原

4、的表達(dá)均最多；A組細(xì)胞凝膠塊中的GAG和Ⅱ型膠原的表達(dá)最少。在培養(yǎng)初期，C組的細(xì)胞凝膠塊收縮程度最大，A組的細(xì)胞凝膠塊收縮程度最小。 結(jié)論：較高的軟骨細(xì)胞接種密度(50×106/ml)抑制軟骨細(xì)胞的增殖，較低的軟骨細(xì)胞接種密度(1×106/ml和10×106/ml)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。細(xì)胞聚集成高密度促進(jìn)軟骨細(xì)胞功能活性的表達(dá)。細(xì)胞凝膠塊體積的變化與細(xì)胞密度密切相關(guān)，較高的細(xì)胞接種密度會(huì)導(dǎo)致初期組織收縮增大，目前認(rèn)為軟骨細(xì)胞主動(dòng)

5、收縮是造成細(xì)胞凝膠復(fù)合物收縮的主要因素，故需要進(jìn)一步研究細(xì)胞密度對(duì)軟骨細(xì)胞中SMA表達(dá)情況的影響。本實(shí)驗(yàn)條件下，50×106/ml為最佳細(xì)胞接種密度，但收縮最明顯。 實(shí)驗(yàn)二、脫細(xì)胞基質(zhì)材料為支架構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究 目的：分別以小腸黏膜下層(Smallintestinesubmucosa，SIS)和脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)(Acellularcartilaginousmatrix，ACM)作支架體外構(gòu)建組織工程軟骨，了解其作

6、為軟骨組織工程支架的可行性。 方法：聯(lián)合應(yīng)用凍干-反復(fù)凍融-酶消化法對(duì)牛軟骨基質(zhì)行脫細(xì)胞處理，聯(lián)合應(yīng)用機(jī)械法和去垢劑-酶消化法制備SIS。將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的2～5代軟骨細(xì)胞分別接種在上述兩種材料上，體外培養(yǎng)3周，觀察軟骨細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)分布情況。 結(jié)果：軟骨細(xì)胞在制備的ACM和SIS上可較好地黏附生長(zhǎng)并增殖，并且分泌大量Ⅱ型膠原和GAG；但軟骨細(xì)胞不能長(zhǎng)入到ACM和SIS內(nèi)部，只能在其表層和表面的結(jié)構(gòu)中生長(zhǎng)，另外只有

7、少量軟骨細(xì)胞分布在ACM物理方式打出的孔隙中。 結(jié)論：ACM和SIS支架材料均具有良好的細(xì)胞相容性和表面活性，并且促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和維持軟骨細(xì)胞表型。需要進(jìn)一步了解ACM和SIS結(jié)構(gòu)和成分對(duì)軟骨細(xì)胞游走趨化能力的影響，促進(jìn)軟骨細(xì)胞均勻分布在材料上。 實(shí)驗(yàn)三、離心培養(yǎng)在構(gòu)建組織工程軟骨中的作用目的：選用離心力作為力學(xué)刺激因素，研究離心力對(duì)軟骨細(xì)胞活性、增殖和功能表達(dá)的影響，了解離心培養(yǎng)方式在體外構(gòu)建組織工程軟骨中的作用。

8、 方法：將裝有3代軟骨細(xì)胞懸液的離心管移到旋轉(zhuǎn)半徑12cm的離心機(jī)上，在轉(zhuǎn)速為500r/min、1000r/min和2000r/min的條件下，分別離心30min、60min、90min、120min、150min或180min后計(jì)數(shù)細(xì)胞總量，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)分離的軟骨細(xì)胞活性。將3代軟骨細(xì)胞接種在ACM上，分別置于靜態(tài)培養(yǎng)和離心培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)8周，動(dòng)態(tài)觀察和測(cè)定材料表層類軟骨組織形態(tài)變化；采用組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色動(dòng)

9、態(tài)觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)以及其中的細(xì)胞密度、GAG、Ⅱ型膠原等成分變化情況；應(yīng)用DMMB分光法定量測(cè)定組織工程軟骨中GAG含量。應(yīng)用胰蛋白酶和膠原酶消化組織分離出軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)軟骨細(xì)胞數(shù)量，了解軟骨細(xì)胞增殖率。 結(jié)果：轉(zhuǎn)速為2000r/min時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)60min，細(xì)胞活性＜90％；轉(zhuǎn)速為500r/min時(shí)，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)120min后，細(xì)胞活性仍保持在90％以上。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，離心培養(yǎng)下的組織工程軟骨GAG含量高于靜態(tài)培養(yǎng)下的組織

10、工程軟骨GAG含量；雙因素方差分析，培養(yǎng)方式因素效應(yīng)差異顯著(P＜0.05)，時(shí)間因素效應(yīng)差異顯著(P＜0.05)。體外相同時(shí)間段，靜態(tài)和離心培養(yǎng)下的軟骨細(xì)胞增殖倍數(shù)不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，離心培養(yǎng)下的軟骨細(xì)胞增殖速度高于靜態(tài)培養(yǎng)下的軟骨細(xì)胞速度。另外，靜態(tài)培養(yǎng)的組織較離心培養(yǎng)的組織Ⅱ膠原免疫組織化學(xué)染色較弱。離心力改變了軟骨細(xì)胞在脫細(xì)胞牛軟骨基質(zhì)上的空間排列，最終形成的類軟骨組織具有一定層次排列結(jié)構(gòu)，但這種結(jié)構(gòu)與正常軟骨的

11、排列有較大的區(qū)別。 結(jié)論：對(duì)軟骨細(xì)胞施加528g(轉(zhuǎn)速：2000r/min)離心力，對(duì)細(xì)胞活性有較大損傷，故不適合于作為體外構(gòu)建組織工程軟骨的培養(yǎng)條件；施加33g(轉(zhuǎn)速：500r/min)離心力，對(duì)細(xì)胞活性影響較小，不會(huì)造成軟骨細(xì)胞損傷。對(duì)軟骨組織所施加的132g(轉(zhuǎn)速：1000r/min)離心力刺激軟骨細(xì)胞合成GAG和Ⅱ型膠原增多，并且促進(jìn)軟骨細(xì)胞快速增殖到達(dá)較高的細(xì)胞濃度，影響組織的排列結(jié)構(gòu)。離心培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨具