新型強(qiáng)效抗腫瘤抗生素谷田霉素的生物合成研究.pdf

1、以DNA為靶體、通過DNA烷基化修飾而表現(xiàn)活性的天然產(chǎn)物在抗腫瘤藥物中占有重要的地位。2003年，日本科學(xué)家。Igarashi發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物谷田霉素(Yatakemycin)屬于這一家族，該化合物以其獨特的分子結(jié)構(gòu)、顯著強(qiáng)效的生物活性引起了全世界生物學(xué)家、化學(xué)家的注意。2004年，美國化學(xué)家Dale L．Boger首次完成了谷田霉素的化學(xué)全合成，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修正，并提出了烷基化DNA的模型：2006年，日本科學(xué)家TohruFukuya

2、ma又一次成功地完成了谷田霉素的全合成。但是，谷田霉素的生物合成研究迄今為止還沒有報道。本論文以谷田霉素分子為目標(biāo)分子，采取多種策略克隆其生物合成基因簇，希望通過體內(nèi)基因敲除和體外生化相結(jié)合研究其中編碼基因的功能，從而系統(tǒng)闡明谷田霉素的生物合成途徑。 首先運用分子生物學(xué)方法，利用Fosmid黏粒作為載體成功地構(gòu)建了谷田霉素產(chǎn)生菌Streptomyces sp．TP-A0356的基因組文庫，效價高達(dá)1.8x10<'8>cfu/μg

3、 DNA，具有良好的質(zhì)量，滿足文庫篩選的需要，為克隆谷田霉素的生物合成基因簇創(chuàng)造了條件。 同時，通過 Streptomyces sp．TP-A0356與大腸桿菌S17-1之間的屬間接合轉(zhuǎn)移成功地建立了 Streptomyces sp．TP-A0356的遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，為體內(nèi)的基因遺傳操作建立了方法。 利用改進(jìn)的固體發(fā)酵方法成功高效地獲得了谷田霉素，并建立了穩(wěn)定的發(fā)酵－分析一鑒定方法，為谷田霉素的代謝工程和組合生物研究奠定了

4、基礎(chǔ)。 根據(jù)對谷田霉素生物合成途徑的推測，我們設(shè)計簡并性引物，通過PCR擴(kuò)增的方法克隆了一個羥化酶、兩個連接酶以及酪氨酸酶的編碼基因片段。盡管體內(nèi)基因中斷表明它們與谷田霉素的生物合成無關(guān)，但這些研究為進(jìn)一步克隆谷田霉素的生物合成簇進(jìn)行了必要的、有意義的嘗試和探索。 綜上所述，我們成功的建立了 Streptomyces sp．TP-A0356的基因文庫、遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、發(fā)酵及分析方法，這些使得克隆谷田霉素基因簇成為可能。所有