核苷類抗生素Muraymycin生物合成機理的研究.pdf

1、muraymycin是從鏈霉菌Streptomyces sp.NRRL30471的發(fā)酵產(chǎn)物中分離到的一類新型核苷-脂肽類抗生素。該抗生素結構比較獨特,含有一個異卷須霉啶(epicapreomycidine)和一個脲鍵,而且該抗生素的所有組分都含有一個連接短肽的糖基化的糖醛酸。Muraymycin與近年來研究得比較多的核苷類抗生素如殺綠霉素(pacidamycin)和卡普拉霉素(caprazamycin)結構類似。
　　 mura

2、ymycin通過抑制細菌細胞壁的合成來達到抑菌效果,它的作用靶標是細菌肽聚糖合成的轉位酶Ⅰ(MraY),此酶催化ρ-N-乙酰胞壁酸五肽形成lipidⅠ——肽聚糖合成途徑中的一種重要的中間體。近來,由于肽核苷類抗生素結構獨特以及作用于新的靶標,所以引起廣泛的關注。到現(xiàn)在為止,尼可霉素(nikkomycin)、多氧霉素(polyoxin)、卡普拉霉素(caprazamycin)、脂硫霉素(liposidomycin)、A500359和殺綠霉

3、素(pacidamycin)等抗生素的生物合成基因簇都已經(jīng)被克隆。
　　 自2002年被發(fā)現(xiàn)以來,關于muraymycin的研究集中在化學合成它的組分及其類似物以期獲得更好的活性以及選擇性,而對此抗生素的生物合成機制一無所知。
　　 本課題組構建了Streptomyces sp.NRRL30471的基因組文庫,并利用muraymycin類似的抗生素卡普拉霉素(caprazamycin)生物合成的基因cpz14,設計簡并引

4、物從此文庫中篩選出14個陽性克隆。將其中18F3測序,結果顯示,此43-4-kb的連續(xù)片段包含33個ORF,推測其中的26個可能涉及muraymycin的生物合成。利用遺傳學方法分別中斷mur16和mur17基因都導致muraymycin生物合成的終止,說明這兩個基因都是此抗生素生物合成的必需基因。另外,中斷mur32基因導致muraymycin的產(chǎn)量急劇下降,而中斷mur34基因導致產(chǎn)量急劇上升,說明前者是此基因簇中的正調(diào)控基因,而后

5、者是負調(diào)控基因。利用pET系統(tǒng)表達Mur34蛋白并通過鎳柱純化,將之與muraymycin生物合成基因簇中的5個啟動子區(qū)DNA片段進行結合實驗,結果顯示,Mur34蛋白可以結合mur33/32及mur36/35的啟動子區(qū)DNA,暗示該蛋白可能通過結合下游的mur33/32及mur36/35的啟動子DNA區(qū)來調(diào)控這四個基因的轉錄。另外,通過將改造過的18F3 cosmid整合到S.lividans TK24的基因組中并發(fā)酵,成功異源表達出