粘細(xì)菌的篩選及其產(chǎn)生的新型抗腫瘤抗生素.pdf

1、粘細(xì)菌(myxobacteria)是一類近年來(lái)引起廣泛關(guān)注，但卻研究尚少的重要藥源微生物類群。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)，粘細(xì)菌分為12個(gè)屬，約40個(gè)種。本課題在粘細(xì)菌傳統(tǒng)篩選方法的基礎(chǔ)上，采用高通量的試管培養(yǎng)方法，對(duì)分離的粘細(xì)菌進(jìn)行了較大規(guī)模的篩選和初步鑒定，得到了376株粘細(xì)菌，并對(duì)其中的67株菌初步歸到屬。以埃坡霉素(Epothilones)的特征為篩選依據(jù)，篩選出在紫外區(qū)間掃描具有較強(qiáng)吸收的樣品312個(gè)。 以B16、SGC7901腫

2、瘤細(xì)胞系為篩選模型，對(duì)上述菌株經(jīng)高通量定向篩選得到了45株產(chǎn)生高抑瘤活性物質(zhì)的粘細(xì)菌菌株，復(fù)篩得到了六株菌，結(jié)合多種顯微技術(shù)對(duì)它們進(jìn)行了鑒定與分類，WXNXJ-A為多囊菌屬(Polyangiumsp.)，WXNXJ-B為標(biāo)樁菌屬(Stigmatellasp.)，WXNXJ-C為堆囊菌屬(Sorangiumsp.)，WXNXJ-D、WXNXJ-E為粘球菌屬(Myxococcussp.)，WXNXJ-F為囊孢桿菌屬(Cystobacters

3、p.)。 對(duì)六株粘細(xì)菌產(chǎn)物復(fù)篩的結(jié)果顯示，粘細(xì)菌菌株WXNXJ-A和WXNXJ-C代謝產(chǎn)生的物質(zhì)不僅對(duì)小鼠黑色素瘤B16(IC50值，0.2715/0.0082μg/mL)、人胃腺癌SGC7901細(xì)胞株(IC50值，4.192/0.0362μg/mL)具有很高的抑制活性，而且對(duì)人肝癌Bel7402、人非小細(xì)胞肺癌H446、人乳腺癌MCF-7等細(xì)胞株也具有較高的抑制活性。 通過(guò)HPLC分析和LC/MS分析驗(yàn)證了菌株WXNX

4、J-C發(fā)酵產(chǎn)物在HPLC分析的圖譜中保留時(shí)間tR=32.6min(flow：0.50mL/min)的物質(zhì)是epothiloneB。 由優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究了WXNXJ-C菌株最佳生長(zhǎng)規(guī)律，確定細(xì)胞最佳生長(zhǎng)時(shí)間為3d，發(fā)酵產(chǎn)生epothiloneB的最佳時(shí)間為6d，并確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成以及氨基酸和微量元素的最佳添加量。培養(yǎng)基優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵得到epothiloneB最高產(chǎn)量31.95mg/L。 WXNXJ-C菌株發(fā)酵產(chǎn)物中有7

5、個(gè)具有較高抗癌活性和較寬的抗腫瘤譜的物質(zhì)。經(jīng)C-18層析柱、15rpc柱、C-18制備柱等多次分離、純化，采用LC/MS、MALDI-TOF、MS/MS、IR、NMR等分析技術(shù)對(duì)7F組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，得到分子量為424Da的C22H32O8，系統(tǒng)名稱為[1R，7R，8R，10S，11S，12S，13S]-1，7，12，13-tetrahydroxy-14-methoxy-8，10-dimethyl-6-phenyl-5，15-dioxa

6、-bicyclo[9.3.1]pentadecan-4-one；1,7，12，13-四羥基-14-甲氧基-8，10-二甲基-6-苯基-5，15-二氧.雙環(huán)[9.3.1]十五烷-4-酮)，起名Phoxalone。查新確證Phoxalone是粘細(xì)菌WXNXJ-C產(chǎn)生的一種新型的含有15元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯化合物。根據(jù)LC/MS、MALDI-TOFMS/MS分析結(jié)果，對(duì)Phoxalone的離子碎片進(jìn)行了解析，構(gòu)建了其分子離子結(jié)構(gòu)，并對(duì)其可能產(chǎn)生的途

7、徑及機(jī)理進(jìn)行了初步研究。 通過(guò)對(duì)Phoxalone、Soraphen、epothilones和Paclitaxel的構(gòu)象進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)Phoxalone有7個(gè)手性C原子，2個(gè)手性對(duì)稱中心，結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單，有利于合成和修飾；與epothilone空間結(jié)構(gòu)比較推測(cè)出二者在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面可能有相似的作用機(jī)制。 以B16、Bel7402、MCF-7、H446、SGC7901、L02等細(xì)胞系為篩選模型，對(duì)Phoxalone進(jìn)行

8、的體外抑制腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明：Phoxalone不僅有較高的抗腫瘤活性和較廣的抗腫瘤譜，而且對(duì)人正常肝細(xì)胞的毒性也比較小。以人非小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞系為模型，經(jīng)Phoxalone處理后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Phoxalone對(duì)H446細(xì)胞系具有較強(qiáng)的抑制作用。 對(duì)細(xì)胞凋亡周期的研究解釋了Phoxalone的作用機(jī)制，細(xì)胞經(jīng)Phoxalone作用48h后在G2/M期被阻滯，能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)量

9、效關(guān)系。以熒光染料PI和膜聯(lián)蛋白(annexin)V雙重染色作用的細(xì)胞，流式分析的結(jié)果表明，Phoxalone可能在不影響細(xì)胞膜完整性的情況下，誘導(dǎo)H446細(xì)胞線粒體△ψm下降，同樣證實(shí)了阻止細(xì)胞分裂在G2/M期。 通過(guò)對(duì)H446細(xì)胞系凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)分析表明，作用48h后Phoxalone通過(guò)上調(diào)H446細(xì)胞中促凋亡因子Bax、下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2，以及上調(diào)線粒體依賴的Caspase-3，激活凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋