受者或第三方淋巴細(xì)胞輸注預(yù)防及治療小鼠GVHD的研究.pdf

1、研究背景： 異基因造血干細(xì)胞移植可以治愈許多血液系統(tǒng)及非血液系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病，移植的主要并發(fā)癥之一為急慢性移植物抗宿主病(GVHD)，是造成移植后非復(fù)發(fā)死亡的最常見(jiàn)原因之一。用具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞成份來(lái)調(diào)控GVHD是近幾年防治GVHD的一種新策略。目前研究較多的細(xì)胞成份有CD4+CD25+Tregs、間充質(zhì)干細(xì)胞、受者自身淋巴細(xì)胞等，在眾多具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠降低GVHD的細(xì)胞中，受者或第三方淋巴細(xì)胞具有采集方便、無(wú)需特殊分離

2、培養(yǎng)，易于臨床應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。本課題選擇此類細(xì)胞作為對(duì)象，研究其在防治GVHD中的作用，以期為臨床提供一種控制GVHD的新方法。 第一部分：建立小鼠同種異體造血干細(xì)胞移植GVHD模型 [目的]：建立完全異基因造血干細(xì)胞移植及單倍型相合造血干細(xì)胞移植GVHD的動(dòng)物模型，為探討受者或第三方淋巴細(xì)胞對(duì)同種異體造血干細(xì)胞移植GVHD的影響提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 [方法]： 1.以近交系C57BL/6(H-2b)小鼠作為供者，

3、BALB/c(H-2d)作為受者，給予受者9.0Gy全身照射，進(jìn)行骨髓細(xì)胞+脾細(xì)胞移植，建立完全異基因造血干細(xì)胞移植GVHD動(dòng)物模型； 2.以C57BL/6(H-2b)作為供者，以(C57BL/6×BALB/c)F1(H-2b/d)(以下簡(jiǎn)稱B6CF1)作為受者，給予受者9.0Gy全身照射，進(jìn)行骨髓細(xì)胞+脾細(xì)胞移植，建立單倍型相合造血干細(xì)胞移植GVHD動(dòng)物模型。 [結(jié)論]：本實(shí)驗(yàn)成功地建立了完全異基因造血干細(xì)胞移植及單倍

4、型相合造血干細(xì)胞移植GVHD的動(dòng)物模型，可利用此模型研究受者或第三方淋巴細(xì)胞對(duì)同種異體造血干細(xì)胞移植GVHD的影響。 第二部分：受者淋巴細(xì)胞輸注預(yù)防小鼠同種異體造血干細(xì)胞移植GVHD的研究 [目的]：探討受者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)小鼠同種異體造血干細(xì)胞移植GVHD的發(fā)生是否起預(yù)防作用。 [方法]： 1.受者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)全異基因造血干細(xì)胞移植GVHD的預(yù)防作用 以BALB/c(H-2d)作為完全異基因造血

5、干細(xì)胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機(jī)分為四組：①對(duì)照組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，但不進(jìn)行其他治療處理，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；②1/6量受者淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為5.0×106，相當(dāng)于移植的C

6、57BL/6小鼠脾細(xì)胞量的1/6)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；③1/3量受者淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞量的1/3)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況。④等量受者淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4

7、.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為3.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞全量)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況。 2.受者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)單倍型相合造血干細(xì)胞移植GVHD的預(yù)防作用 以B6CF1(H-2b/d)作為單倍型相合造血干細(xì)胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機(jī)分為四組：①對(duì)照組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠

8、混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，但不進(jìn)行其他治療處理，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；②1/3量受者淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射B6CF1小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞量的1/3)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；③等量受者淋巴細(xì)胞輸注組：

9、經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射B6CF1小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為3.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的全量)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；④1.5倍量受者淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射B6CF1小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為4.

10、5×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的1.5倍量)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況。 [結(jié)論]：小鼠同種異體造血干細(xì)胞移植后輸注適當(dāng)劑量的受者淋巴細(xì)胞，可以顯著降低造血干細(xì)胞移植后GVHD的發(fā)生率。 第三部分：第三方淋巴細(xì)胞輸注預(yù)防小鼠同種異體造血干細(xì)胞移植GVHD的研究 [目的]：探討第三方淋巴細(xì)胞輸注對(duì)小鼠同種異體造血干細(xì)胞移植GVHD的發(fā)生是否起預(yù)防作用。 [方法]：

11、1.父系淋巴細(xì)胞輸注對(duì)單倍型相合造血干細(xì)胞移植GVHD的預(yù)防作用 以子代B6CF1(H-2b/d)作為單倍型異基因造血干細(xì)胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機(jī)分為三組：①對(duì)照組：經(jīng)尾靜脈注射母系C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，但不進(jìn)行其他治療處理，觀察其造血恢復(fù)、植入及OVHD的發(fā)生情況；②1/6量父系淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×

12、106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射父系BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為5.0×106，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞量的1/6)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；③1/3量父系淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射父系BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6

13、小鼠脾細(xì)胞量的1/3)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況。 2.子代淋巴細(xì)胞輸注對(duì)完全異基因造血干細(xì)胞移植GVHD的預(yù)防作用 以BALB/c(H-2d)作為完全異基因造血干細(xì)胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，隨機(jī)分為四組：①對(duì)照組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，但不進(jìn)行其他治療處理，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；②1/3量子代淋巴

14、細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射子代B6CF1小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞量的1/3)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；③等量子代淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射子代B6CF1小鼠脾細(xì)

15、胞懸液(數(shù)量為3.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的全量)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況；④1.5倍量子代淋巴細(xì)胞輸注組：經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，并于移植4d后經(jīng)尾靜脈注射子代B6CF1小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為4.5×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的1.5倍量)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的發(fā)生情況。 [結(jié)論]：小鼠同

16、種異體造血干細(xì)胞移植后輸注適量的第三方淋巴細(xì)胞(可以是親代或子代)，可以顯著降低造血干細(xì)胞移植后GVHD的發(fā)生率。 第四部分：受者淋巴細(xì)胞輸注治療小鼠完全異基因造血干細(xì)胞移植GVHD的研究 [目的]：探討受者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)小鼠完全異基因造血干細(xì)胞移植GVHD的發(fā)生是否起治療作用。 [方法]： 1.以BALB/c(H-2d)作為完全異基因造血干細(xì)胞移植的受鼠，給予9.0Gy全身照射后4h，經(jīng)尾靜脈注射C57

17、BL/6小鼠混合細(xì)胞懸液(4.5×106骨髓細(xì)胞+3.0×107脾細(xì)胞)，但不進(jìn)行其他治療處理，出現(xiàn)GVHD征象后，隨機(jī)分為三組； 2.對(duì)照組：不進(jìn)行任何治療，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的轉(zhuǎn)歸情況； 3.單純受者淋巴細(xì)胞輸注組：出現(xiàn)GVHD征象后，經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液(數(shù)量為1.0×107，相當(dāng)于移植的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞量的1/3)，觀察其造血恢復(fù)、植入及GVHD的轉(zhuǎn)歸情況。 4.氟達(dá)