豬流行性腹瀉病毒的流行病學(xué)調(diào)查及快速檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea， PED)是一種急性胃腸炎疾病，其主要癥狀為水樣腹瀉和嘔吐，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種世界性傳染病。2010年我國(guó)南部大面積爆發(fā)豬流行性腹瀉疫情，各個(gè)年齡段的豬均發(fā)病，新生仔豬的發(fā)病率和死亡率都很高。為了了解近兩年該病在我國(guó)的流行病學(xué)特點(diǎn)和建立快速檢測(cè)方法，我們主要開(kāi)展了以下研究:<

2、br>　　1.豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析
　　為了調(diào)查我國(guó)豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異情況，本研究通過(guò)RT-PCR方法對(duì)從江蘇、吉林、上海、廣東、河南五省市規(guī)模豬場(chǎng)采集來(lái)的314份樣本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)出PEDV陽(yáng)性病料76份，陽(yáng)性率達(dá)24.2％，其中廣東省幾個(gè)豬場(chǎng)的PEDV陽(yáng)性率最高，高達(dá)94.7％，吉林省幾個(gè)豬場(chǎng)沒(méi)檢出PEDV陽(yáng)性，另外江蘇省、河南省和上海市的PEDV陽(yáng)性率分別為17.8％、31.6％和27.6％，表明PE

3、D在我國(guó)部分地區(qū)仍流行嚴(yán)重，有必要對(duì)PED采取更加嚴(yán)格的防范措施。對(duì)部分陽(yáng)性樣品中PEDV的S1、M、ORF3基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和比對(duì)分析，結(jié)果表明我國(guó)大部分流行株與韓國(guó)、美國(guó)流行株同源性較近，與歐洲流行株以及疫苗株CV777同源性較遠(yuǎn)，只有HN13和YM毒株與歐洲流行株和疫苗株CV777同源性較近。比對(duì)發(fā)現(xiàn)S1蛋白氨基酸發(fā)生變異明顯，M蛋白和ORF3蛋白的氨基酸較為保守，另外HN13和YM毒株的ORF3基因與疫苗株DR13的ORF3基

4、因相同，有49個(gè)核苷酸缺失。
　　2.豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的研制及特性鑒定
　　為了獲得可用于建立PEDV快速檢測(cè)方法的單克隆抗體，本研究將超速離心法純化的PEDV作為免疫原，免疫6～8周齡Balb/c小鼠，利用免疫熒光法(IFA)篩選出9株能夠穩(wěn)定分泌抗PEDV抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為PEDV-1C12、PEDV-2A9、PEDV-2C11、PEDV-2E5、PEDV-2F1、PEDV-3E9、PEDV-5B1

5、2、PEDV-6D1、PEDV-6E10;隨后對(duì)單克隆抗體的腹水熒光效價(jià)、亞類(lèi)以及特異性等生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。單克隆抗體亞類(lèi)鑒定結(jié)果顯示，7株單克隆抗體亞類(lèi)為IgG，2株為IgM;其腹水的IFA效價(jià)分別為:5.12×104、1.08×104、5.12×104、2.16×104、1.08×104、2.048×105、3.2×103、1.024×105、1.024×105;Western-blot結(jié)果表明，8株單克隆抗體是PEDVN蛋白特異

6、性抗體，PEDV-2A9有可能為針對(duì)構(gòu)象表位的抗體。
　　3.豬流行性腹瀉病毒快速檢測(cè)方法的初步建立
　　為了建立豬流行性腹瀉病毒快速檢測(cè)方法，本研究利用檸檬酸三鈉還原法制備了粒徑30nm的膠體金溶液，采用雙抗體夾心的原理制備PEDV膠體金試紙條。即將金標(biāo)抗體PEDV-2C11噴于金標(biāo)墊上;將兔抗鼠IgG和單抗PEDV-1C12分別噴于NC膜的C線和T線。本試紙條能夠特異性的針對(duì)PEDV，而不與正常組織或細(xì)胞反應(yīng)。最低能夠檢