豬流行性腹瀉病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起豬的一種急性腸道傳染病，主要導(dǎo)致感染豬的腹瀉、嘔吐及脫水癥狀，對(duì)哺乳仔豬有很高的致死率，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的比較常用的PEDV診斷方法有免疫熒光、ELISA、免疫組化、RT-PCR等，但是這些方法操作費(fèi)時(shí)且特異性、靈敏度不高，而且不能對(duì)疾病作出早期診斷，而熒光定量PCR則能夠彌補(bǔ)這些缺陷，且可進(jìn)行高通量檢測(cè)。
　　 PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA

2、病毒，其基因組中的M基因特別保守，通常被用來(lái)作為檢測(cè)方法的靶基因。我們參考GenBank中已經(jīng)公布的PEDV CV777株，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增M基因全長(zhǎng)的特異性引物，另外設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物及TaqMan探針，擴(kuò)增長(zhǎng)度為196 bp的片段。利用RT-PCR技術(shù)，從陽(yáng)性病料中擴(kuò)增出681 bp的M基因，序列比對(duì)結(jié)果表明，M基因序列與CV777株相應(yīng)M序列的同源性高達(dá)98％，并且與已經(jīng)發(fā)布的其它PEDV毒株的M基因序列相比，同源性也均在97％以上。我

3、們將M基因克隆進(jìn)pMD18-T載體中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度系列稀釋以作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，從而建立了一種快速檢測(cè)PEDV含量的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，并對(duì)該方法的特異性、敏感性及重復(fù)性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，反應(yīng)模板的濃度和CT值呈良好的線性關(guān)系，建立的方程為y=-3.656gx+42.42，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999，可檢測(cè)出最低濃度為200 copies/μL的PEDV反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，比常規(guī)RT-PCR方法的靈敏度高100

4、倍。臨床采集30份腹瀉病料，用建立的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)出26份陽(yáng)性，而常規(guī)RT-PCR僅檢測(cè)出22份陽(yáng)性。
　　 為了分析豬流行性腹瀉病毒變異毒株F J-9、YN-1、GD-01的致病性，本研究通過(guò)人工口服感染方式，將含有這3種變異毒株的病料各感染2頭3日齡未食初乳的PEDV陰性仔豬，另設(shè)兩頭陰性對(duì)照仔豬。用熒光定量RT-PCR、HE染色、免疫組化等方法，評(píng)價(jià)了其在糞便排毒、組織病理?yè)p傷、病毒在豬體內(nèi)分布及復(fù)制

5、等情況。結(jié)果表明，攻毒仔豬在攻毒后(post-infection，PI)13-25h全部出現(xiàn)腹瀉癥狀，并間或嘔吐，嚴(yán)重脫水;在PI8-20h陸續(xù)在糞便中檢測(cè)到PEDV陽(yáng)性，并在此后一直保持較高的排毒量。剖檢可見(jiàn)攻毒仔豬的病理變化主要表現(xiàn)在小腸和胃。腸管變薄，內(nèi)含黃色水樣糞便;胃膨脹，胃壁變薄，內(nèi)含凝乳塊。HE染色結(jié)果顯示，攻毒組仔豬的小腸的腸絨毛明顯縮短、變粗，固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主;腸壁漿膜層變薄;絨毛上皮細(xì)胞呈立方狀，部