廣東及周邊省份豬流行性腹瀉分子流行病學(xué)調(diào)查及豬氨基肽酶N多抗的制備.pdf

1、2010年十月，我國大面積爆發(fā)豬流行性腹瀉（PED），在短短一年時間內(nèi)，造成多個省份超過100萬頭豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。廣東省作為全國養(yǎng)豬大省，在此之后，雖大部分豬場均采用疫苗免疫預(yù)防PED，但效果并不理想。
　　本次實(shí)驗中，采集2015-2016年廣東省及周邊省份臨床表現(xiàn)為腹瀉的樣品共178份，通過RT-PCR對這些樣品進(jìn)行PEDV、TGEV、RV檢測，選取20個PEDV陽性樣品，通過RT-PCR擴(kuò)增毒株的S

2、基因全序列、M基因全序列以及ORF3基因全序列并克隆至載體測序，并與GenBank已經(jīng)發(fā)布的毒株序列比較，分析廣東省及周邊省份PED流行毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，核苷酸序列及氨基酸序列同源性以及序列位點(diǎn)變化。
　　本實(shí)驗178份樣品中，有137份樣品顯示PED陽性，6份樣品顯示TGE陽性，10份樣品顯示RV陽性，陽性率分別為77.0％、3.4%、5.6%。從結(jié)果中可看出，冬季與春季PED的陽性率明顯高于其他兩季。從S基因遺傳進(jìn)化關(guān)系來看

3、，本實(shí)驗所得20個 PEDV毒株均與中國2010年之后分離毒株 CH/GDZQ/2014與CH/HNLH/2015親緣關(guān)系較近。分析S基因及其編碼蛋白序列，與經(jīng)典毒株CV777比較，有15個堿基插入與6個堿基的缺失，導(dǎo)致N58Q/HGV61和N140氨基酸插入， D164I165氨基酸缺失。比較其四個抗原表位，分別具有10～15個氨基酸的變異。分析M基因遺傳進(jìn)化關(guān)系可知，20個樣品核苷酸同源性為97.2%～100.0%，氨基酸同源性96

4、.5%～100%，與CV777、83P-5、Br1/87之間的核苷酸同源性為97.5%～99.6%，氨基酸同源性為97.4%～99.1%，說明M基因較為保守。實(shí)驗中M基因與近年來的流行毒株一樣具有3個氨基酸突變。分析20株毒株的ORF3基因可知20個毒株均為675bp，沒有缺失，屬于流行強(qiáng)毒株。同源性分析表明20個樣品之間核苷酸同源性為98.2%～100.0%，氨基酸同源性98.2%～100.0%，同源性較高，與 DR13同源性較高，核

5、苷酸同源性為97.9%～98.4%，氨基酸同源性為98.2%～99.6%。分析其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)具有8個氨基酸突變，與韓國毒株DR13非常相似。這些結(jié)果表明，廣東省及其周邊省份豬場中普遍存在豬流行性腹瀉病毒，其基因也在不斷變化。
　　為了進(jìn)一步了解廣東省及其周邊省份 PED流行毒株的性質(zhì)、功能及感染特性，因此需要深入了解作為PEDV受體的豬氨基肽酶N（pAPN）的基本性質(zhì)，作用方式以及其功能特性，并為后續(xù)實(shí)驗做準(zhǔn)備。根據(jù)GenBan

6、k中登錄號為NM_214277的豬氨基肽酶 N序列設(shè)計一段引物，擴(kuò)增其中1176bp，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體 pET-32a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-APN-C。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)條件，表達(dá)與預(yù)期大小相符的約53kDa的蛋白，可溶性分析結(jié)果表示其蛋白主要存在于包涵體中。將融合蛋白純化后，免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體。3次免疫后心臟采血，通過免疫印跡試驗檢測其特異性，并用