豬流行性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起初生仔豬以嘔吐、急性腹瀉、嚴(yán)重脫水為特征的一種高度接觸性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床上，PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PRoV)所致疫病的癥狀極為相似，難以區(qū)分，需借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)加以診斷。建立快速、特異的PEDV、TGEV、PRoV鑒別檢測(cè)方法，對(duì)有效防控豬腹瀉類疾病具有重要意義。
　　1.PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR檢測(cè)

2、方法的建立及應(yīng)用
　　為建立PEDV、TGEV及PRoV的快速鑒別檢測(cè)方法，本試驗(yàn)針對(duì)PEDV、TGEV、PRoV的基因組序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6，分別擴(kuò)增PEDVN基因、TGEVM基因和PRoVVP6基因。經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件，成功建立了能同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。該方法可特異擴(kuò)增PEDV、TGEV、PRoV相應(yīng)的基因片段，而與豬瘟病毒(CSFV)、豬口

3、蹄疫病毒(FMDV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)均無交叉反應(yīng);對(duì)PEDV、TGEV、PRoV基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出下限為1.41×103、1.41×102和1.41×103拷貝/μL。應(yīng)用該方法對(duì)臨床采集的190份腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果PEDV陽性42份，陽性率22.11％;TGEV陽性58份，陽性率30.53％;PRoV陽性34份，陽性率17.89％，且存在不同病毒混合感染的現(xiàn)象。結(jié)果

4、表明，所建立的多重RT-PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于PEDV、TGEV和PRoV的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
　　2.豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和疫苗株多重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　建立PEDV不同毒株的快速鑒別檢測(cè)方法，針對(duì)PEDV基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物。第1對(duì)引物擴(kuò)增野毒株（經(jīng)典株、變異株）和疫苗株ORF3基因198 bp和148 bp片段;第2對(duì)引物擴(kuò)增經(jīng)典株和疫苗株S基因42

5、9 bp片段;第3對(duì)引物擴(kuò)增變異株S基因274bp片段。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PEDV經(jīng)典株、變異株及疫苗株的多重RT-PCR檢測(cè)方法。該方法可以特異擴(kuò)增PEDV，而與豬的其他重要病原FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRoV、PCV2、PRV無交叉反應(yīng);對(duì)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出下限為2.62×102copies/μL;重復(fù)試驗(yàn)獲得了均勻一致的結(jié)果。應(yīng)用該方法檢測(cè)336份臨床病料，PEDV陽性120份，其中變