Skp2基因沉默對人肺癌細胞生物學活性的影響及機制研究.pdf

1、肺癌是一種常見惡性腫瘤，發(fā)病率高，嚴重影響人們的生活質量。20世紀80年代以來，肺癌的治療取得了較大的進展，手術、放療、化療和免疫治療的聯(lián)合應用，大大提高了患者的5年生存率。但手術、放療和化療并發(fā)癥多、毒副作用大。尋找新的有效、簡便、毒副作用小的治療方法成為醫(yī)務工作者關注的焦點。 目前方興未艾的基因治療可能成為很有前景的腫瘤治療方式之一，RNA干擾屬于基因治療的一種新的方式。RNA干擾(RNA interferenceRNAi)

2、現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于1995年，迅速引起研究者的重視。RNAi是由雙鏈RNA介導的、在轉錄后水平封閉或沉默相應基因表達的基因阻斷技術，其原理是小片段RNA(siRNA)依據堿基互補的原理，特異性地結合癌基因的mRNA，干擾其翻譯、轉錄形成蛋白質的功能，阻抑癌蛋白的生成，抑制癌細胞生長或誘導細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。RNA干擾已經廣泛應用于基因功能和各種腫瘤的治療的研究中。 腫瘤實質上是一種細胞周期調控紊亂性疾病。細胞周期的

3、調控是一個及其復雜的過程，涉及到多因子、在多層次上的作用，在細胞周期調控中正性調控因子和負性調控因子之間的平衡失調將導致細胞周期出現(xiàn)紊亂，而泛素蛋白酶體系統(tǒng)通過對多種類型的短壽命周期調控因子的降解，保持細胞周期運行中正負調控因子之間的平衡，保證細胞周期的順利運行，在細胞周期調控中發(fā)揮重要作用。Skp2屬于泛素蛋白酶體系統(tǒng)中F-box蛋白家族中一員，在泛素化降解蛋白質過程中負責對底物蛋白的特異性識別，通過對多種靶蛋白的泛素化降解參與細胞周

4、期調控。 S期激酶相關蛋白2(Skp2)是Zhang等人于1995年發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質，因最初發(fā)現(xiàn)它在S期與細胞周期蛋白結合的一種蛋白質，所以命名為S期激酶相關蛋白。Skp2是泛素蛋白連接酶SCFSKP2的特異性識別底物的亞單位，屬于F-box的家庭成員。Skp2參與了對細胞周期依賴性激酶抑制因子p27、p21、p57、130/pRb2、E2F1、cyclin E和hOrclp等細胞周期因子的泛素化降解過程。Skp2通過促進細胞周期蛋白酶

5、抑制物p27、p21的降解，推動細胞周期從G期向S期轉換。研究發(fā)現(xiàn)Skp2過表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后密切相關，近年來許多研究表明Skp2蛋白在許多惡性腫瘤組織及腫瘤細胞的表達增高，而p27蛋白表達是降低的，兩者存在明顯的負相關。許多研究都證實Skp2具有癌基因的特性，Skp2的表達水平及活性與淋巴瘤，口腔鱗狀細胞癌，膠質母細胞瘤，淋巴瘤，乳房癌，結腸癌，肺癌，胃癌的惡性程度、侵襲性、轉移、預后密切相關。Skp2雖與細胞周期密切相關，

6、但它調控細胞增殖以及在腫瘤中的發(fā)病機制仍不清楚。通過抑制Skp2表達，研究其對腫瘤細胞生物學活性的影響，了解與細胞周期調控因子之間的關系，對于揭示Skp2在細胞周期中的功能、在腫瘤中的發(fā)病機制及作為腫瘤治療的靶點的可行性都具有重要意義。 已有大量研究證實采用siRNA表達載體的方法能達到高效、特異抑制目的基因表達的效果，并且能延長對靶基因的抑制作用時間。因此本研究采用與siRNA表達載體相關的干擾技術，旨在探討Skp2 siRN

7、A表達載體對肺癌細胞內源性Skp2基因的沉默作用?；赗NA干擾技術原理，構建Skp2 siRNA質粒質粒載體，采用脂質體包裹技術，將構建的Skp2siRNA質粒轉染SPC-A-1肺癌細胞系，通過沉默肺癌細胞內Skp2基因的表達，采用不同技術方法檢測構建的Skp2 siRNA干擾質粒對肺癌細胞增殖、生長、凋亡的影響，以及對接種的裸鼠腫瘤生長的抑制情況，探討Skp2siRNA表達載體作為肺癌基因治療新策略的可行性以及Skp2在肺癌發(fā)生、發(fā)

8、展中的機制。實驗分三部分： 第一部分： 目的：首先篩選出高表達Skp2基因的肺癌細胞，然后構建Skp2siRNA真核表達質粒，為Skp2基因功能研究打下實驗基礎。 方法：首先篩選出高表達Skp2基因的肺癌細胞株，作為下一步RNAi基因沉默的研究對象。采用RT-PCR和蛋白質印跡技術檢測兩株A549、SPC-A-1肺癌細胞株和Hela細胞中內源性Skp2基因及蛋白的表達，篩選出高表達Skp2基因的肺癌細胞株。然后依

9、據RNA干擾原理，采用RNAi-DNA載體技術，以Skp2基因為靶點，設計、構建、篩選靶向Skp2基因的小干擾RNA。根據人Skp2基因序列及二級結構特征，設計合成寡核普酸，將其插入pGenesil質粒載體，構建針對Skp2基因的RNA干涉真核表達載體。電泳法初步篩選正確的重組克隆。DNA測序驗證重組克隆插入序列的正確性。用構建好的SkpZ siRNA表達載體脂質體介導下轉染高表達Skp2的SPC-A-1肺癌細胞系，熒光鏡下檢測質粒轉染

10、效率，G418篩選出陽性細胞克隆。取穩(wěn)定建株的克隆細胞，RT-PCR、Western blot檢測轉染質粒的肺癌細胞內Skp2 mRNA)及蛋白水平的變化。結果：RT-PCR、Westem blot檢測結果表明：SPC-A-1肺癌細胞和Hela細胞高表達Skp2，而A549肺癌細胞未檢測到Skp2的表達。酶切電泳分析和DNA測序證實重組質粒Skp2 siRNA構建成功；Skp2 siRNA對內源Skp2基因的表達有明顯的抑制作用，明顯高

11、于對照組，抑制率達(71.2±5.5％)、(65.3±4.8％)；Skp2 siRNA對Skp2蛋白明顯抑制作用明顯，抑制率達(74.1±6.3％)、(67.2±5.5％)，與對照組及陰性質粒對照組比較有統(tǒng)計學意義。 結論：SPC-A-1肺癌細胞內高表達Skp2；構建的重組質粒Skp2siRNA能特異、高效抑制SPC-A-1細胞內源性Skp2基因的表達，為下一步研究siRNA對肺癌細胞生長的影響打下實驗基礎。 第二部分：

12、 目的：探討采用RNAi技術抑制Skp2基因表達后，Skp2 siRNA重組質粒對肺癌細胞生長、增殖的抑制情況，以及對細胞周期信號因子p27、p21的影響。 方法：MTT、流式細胞儀檢測Skp2 siRNA重組質粒細胞組和對照組SPC-A-1細胞細胞增殖、細胞周期的變化。流式細胞學、TUNEL技術檢測細胞凋亡。免疫組化、激光共聚焦、Western blot檢測肺癌細胞內p27、p21蛋白的表達改變。RT-PCR檢測p27

13、mRNA基因變化。 結果：Skp2 siRNA重組質粒轉染肺癌SPC-A-1細胞后，細胞生長、增殖明顯被抑制，細胞凋亡增多。細胞周期檢測結果提示：轉染Skp2siRNA重組質粒的細胞進入S期的比例減少，而阻滯在G0/G1期細胞比例增加。在轉染Skp2 siRNA重組質粒的細胞細胞周期調控因子p27、p21蛋白表達增強，而對照組及陰性質粒轉染的肺癌細胞增殖及p27、p21蛋白末見明顯改變。 結論：Skp2 siRNA重組質

14、粒對肺癌細胞SPC-A-1的增殖有明顯抑制作用，并可誘導細胞凋亡增加，抑制細胞內Skp2表達后能上調細胞內細胞周期調控因子p27、p21蛋白的表達。 第三部分： 目的：為探討構建的Skp2 siRNA質粒載體對體內腫瘤生長的影響，采用轉染Skp2 siRNA質粒肺癌細胞建立肺癌動物模型，觀察腫瘤生長情況。 方法：以BALB/c裸鼠為研究對象，采用皮下注射轉染Skp2 siRNA質粒的SPC-A-1細胞和對照組細胞

15、懸液，建立肺癌細胞的裸鼠動物模型：通過觀察腫瘤形成時間，測量腫瘤體積和重量方法觀察腫瘤形成和腫瘤的生長狀況；采用免疫組織化學染色、Western blot檢測腫瘤組織Skp2蛋白的表達。 結果：轉染Skp2 siRNA質粒的肺癌細胞接種裸鼠皮下后，腫瘤生長明顯減慢。與對照組相比，轉染Skp2 siRNA質粒組腫瘤體積明顯縮小，Skp2蛋白下調(73.54±4.2％)、(67.3±3.2％)，而腫瘤內細胞周期調控因子p27、p21