DAL-1基因的蛋白表達及其點突變(1810C-T-575Cys-Tyr)與非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中80％～85％為非小細胞肺癌 (None Small Cell Lung Caneer，NSCLC)。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致NSCLC治療失敗及絕大多數(shù)患者死亡的主要原因，因而尋找肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其分子指標成為當前迫切需要解決的問題。
　　 DAL-1（Differentially expressed in adenocarcinoma of the lung）是4.1家族成員之一，在NSCLC

2、、乳腺癌和腦膜瘤中表達下調(diào)或缺失[1-4]。轉(zhuǎn)染DAL-1至NSCLC和乳腺癌細胞株中使其重新表達，可抑制這些細胞增殖[1,5]，表明DAL-1是一種腫瘤抑制基因。
　　 免疫細胞化學方法顯示DAL-1蛋白定位于細胞膜的胞質(zhì)側(cè)，主要集中在細胞間的連接處，呈“honeycomb”狀分布[1]。Charboneau AL等[6]研究發(fā)現(xiàn)DAL-1表達可以增強乳腺癌細胞之間的連接。我們前期體外實驗發(fā)現(xiàn)，沉默DAL-1蛋白表達可使NSC

3、LC細胞侵襲和遷移能力增強[7]。由此推測，該基因表達缺失可能削弱細胞間的連接和黏附從而導(dǎo)致腫瘤細胞易于發(fā)生脫落和轉(zhuǎn)移。本次實驗我們擬通過對人肺癌組織中DAL-1蛋白表達進行檢測，并與臨床病理因素進行對比分析，進一步驗證DAL-1表達與NSCLC轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 基因失活的機制包括基因缺失、突變等遺傳學機制及DNA甲基化、染色質(zhì)構(gòu)象變化等表觀遺傳學機制。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，DAL-1基因啟動子甲基化是導(dǎo)致NSCLC細胞系和細胞株

4、中DAL-1表達缺失的主要原因；但在部分DAL-1表達缺失的腫瘤細胞中，DAL-1基因啟動子并沒有出現(xiàn)甲基化[7]，因此推測可能存在其他導(dǎo)致DAL-1表達缺失的原因。點突變是基因表達缺失的常見原因之一，目前研究認為DAL-1存在多個點突變位點，包括：1810 C>T/575Cys>Tyr，2166 C>T/704Thr>Thr，2146 G>T/716 Ala>Ser，2166 C>T/722Thr>Thr等，其中1810 C>T/57

5、5Cys>Tyr突變發(fā)生頻率較高，且為錯義突變[8-10]。因此本研究通過對人體組織DAL-1基因1810C>T/575Cys>Tyr點突變的檢測，分析其與DAL-1蛋白表達的關(guān)系，進一步探討DAL-1蛋白表達缺失的原因。
　　 方法：
　　 一、免疫組化方法檢測石蠟包埋的NSCLC組織167例（其中149例備有配對癌旁組織）的DAL-1蛋白表達，分析其與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系。數(shù)據(jù)采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析。

6、r>　　 二、提取204例NSCLC患者配對組織標本（石蠟包埋NSCLC組織和同一患者正常淋巴結(jié)組織）及112例NSCLC患者新鮮血液標本（共316例）基因組DNA，PCR-RFLP方法檢測DAL-1基因1810 C>T基因型，分析1810 C>T點突變與DAL-1蛋白表達及NSCLC轉(zhuǎn)移的關(guān)系。數(shù)據(jù)采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果：
　　 一、167例NSCLC組織中，DAL-1蛋白陽性表達97例（58.1％

7、），陰性70例（41.9％）。其中149例NSCLC配對標本中，癌旁組織DAL-1陽性表達135例（90.6％），陰性14例（9.4％）；癌組織DAL-1陽性表達87例（58.4％），陰性62例（41.6％）；NSCLC癌組織DAL-1陽性表達率顯著低于癌旁組織（p＜0.05）。
　　 二、167例NSCLC組織中，DAL-1蛋白表達陽性率在腫瘤最大直徑≤3cm組(47/66)顯著高于腫瘤最大直徑＞3cm組(50/101)（p＜

8、0.01），未發(fā)生轉(zhuǎn)移組(64/78)顯著高于轉(zhuǎn)移組(33/89)（p＜0.000），Ⅰ期、Ⅱ期(67/91)顯著高于Ⅲ期、Ⅳ期(30/76)（p＜0.000）。其中148例腺癌和鱗癌DAL-1蛋白表達陽性率高、中分化組(63/93)顯著高于低分化組(27/55)（p＜0.005）。
　　 三、316例NSCLC患者DAL-1 1810 C>T基因型分布：野生型基因型TT293例（92.7％），突變型基因型23例，突變率為4.1

9、％。其中CT20例（6.3％），CC3例（0.9％）。204例NSCLC患者正常淋巴結(jié)組織與其NSCLC組織配對資料共408個標本基因型檢測結(jié)果表明：各例NSCLC腫瘤組織和相應(yīng)正常淋巴結(jié)組織基因型完全一致。
　　 四、167例NSCLC組織中，發(fā)生DAL-1 1810 C>T點突變者13例。13例發(fā)生點突變患者的癌組織中DAL-1蛋白陽性表達5例，陰性8例；相應(yīng)的癌旁組織DAL-1蛋白陽性表達7例，陰性5例，1例無配對癌旁組織

10、。5例點突變患者癌組織DAL-1蛋白雖陽性表達，但均發(fā)生轉(zhuǎn)移。提示DAL-1 1810 C>T點突變可能削弱DAL-1對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　 五、在316例標本中，突變的23例中17例發(fā)生轉(zhuǎn)移，6例未發(fā)生轉(zhuǎn)移；在293例野生型的標本中，149例發(fā)生轉(zhuǎn)移，144例未發(fā)生轉(zhuǎn)移，NSCLC轉(zhuǎn)移在DAL-1突變型與野生型組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.025）。提示DAL-1 1810 C>T點突變可能導(dǎo)致NSCLC更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

11、
　　 六、分析經(jīng)免疫組化方法檢測蛋白表達的167例NSCLC組織DAL-1 1810 C>T點突變與腫瘤臨床病理因素關(guān)系發(fā)現(xiàn)，DAL-1 1810 C>T點突變基因型分布頻率在腫瘤最大直徑≤3cm組（6/66）與腫瘤最大直徑＞3cm組（7/101），Ⅰ期、Ⅱ期組（8/91）與Ⅲ期、Ⅳ期組（5/76），組間無顯著性差異（P＞0.05）。DAL-1 1810 C>T點突變基因型分布頻率在轉(zhuǎn)移組（11/89）與無轉(zhuǎn)移組（2/78）間

12、有顯著性差異（P＜0.025）.
　　 結(jié)論：
　　 一、人NSCLC腫瘤組織存在DAL-1蛋白表達降低、缺失現(xiàn)象。
　　 二、NSCLC轉(zhuǎn)移組的DAL-1蛋白表達陽性率顯著低于未轉(zhuǎn)移組，提示DAL-1蛋白表達降低、缺失可能與NSCLC轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 三、人NSCLC組織中DAL-1 1810 C>T突變率為4.1％。DAL-1 1810 C>T點突變不是導(dǎo)致DAL-1蛋白表達降低、缺失的主要原因。DA