DAL-1在肺癌轉(zhuǎn)移早期事件——EMT中的作用.pdf

1、研究背景與目的:
　　肺癌是目前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤,主要和直接的致死原因是腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。目前認為,上皮來源的惡性腫瘤在轉(zhuǎn)移早期經(jīng)歷了上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),即腫瘤細胞上皮表型喪失,出現(xiàn)間質(zhì)細胞或間質(zhì)來源細胞的表型,表現(xiàn)為細胞間粘附能力降低及細胞侵襲及遷移能力增強。
　　抑癌基因DAL-1首先在肺腺癌中發(fā)現(xiàn),近年來研究表明,其表達缺失與多種腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),但其在轉(zhuǎn)移中的作用機制至今尚未闡明。細胞免疫熒光檢測顯

2、示DAL-1蛋白表達于細胞間連接處,與細胞骨架蛋白結(jié)合,參與細胞粘附和運動的調(diào)節(jié)。在腫瘤組織其表達缺失可引起腫瘤細胞間粘附能力下降,侵襲和遷移能力增強,提示DAL-1與EMT的發(fā)生有關(guān)。我們前期采用免疫組化在人肺癌組織標本中檢測發(fā)現(xiàn):DAL-1與E-cadherin表達呈正相關(guān),與Vimentin、Snail表達呈負相關(guān),由此推測DAL-1可能通過調(diào)節(jié)上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,影響肺癌的轉(zhuǎn)移。
　　本研究擬采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建過表達D

3、AL-1載體,轉(zhuǎn)染至肺癌A549細胞中,驗證DAL-1與EMT的關(guān)系;采用雙熒光素酶報告基因技術(shù)及免疫共沉淀方法研究DAL-1對EMT的調(diào)節(jié)機制。
　　方法:
　　一、采用基因克隆的方法在含DAL-1編碼序列的質(zhì)粒上添加終止密碼子,克隆至真核表達載體pcDNA3中,獲得重組質(zhì)粒pcDNA3/DAL-1;經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切后,進行DNA測序鑒定。
　　二、RT-PCR及Western Blot方法檢測7株人肺癌

4、細胞株中DAL-1mRNA和蛋白表達情況,篩選出不表達DAL-1的肺癌A549細胞。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3/DAL-1轉(zhuǎn)染至A549細胞中,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測DAL-1的表達。
　　三、脂質(zhì)體介導重組質(zhì)粒pcDNA3/DAL-1瞬時轉(zhuǎn)染至肺癌A549細胞中,轉(zhuǎn)染48h后采用熒光定量PCR及Western Blot方法檢測過表達DAL-1后E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin

5、及Snail的mRNA及蛋白表達情況;轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)G418篩選培養(yǎng)2周后,擴大培養(yǎng)獲得穩(wěn)定表達DAL-1的細胞。在轉(zhuǎn)染后第3、4、5周采用熒光定量PCR及Western Blot方法檢測DAL-1、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin及Snail的mRNA及蛋白表達情況,分析DAL-1與EMT的關(guān)系。
　　四、構(gòu)建含有E-cadherin啟動子片段的熒光素酶報告基因載體,采用雙熒光素酶報

6、告基因方法檢測DAL-1轉(zhuǎn)染組及空載體組的E-cadherin啟動子轉(zhuǎn)錄活性,分析DAL-1在轉(zhuǎn)錄水平對E-cadherin的調(diào)節(jié)作用;利用穩(wěn)定表達DAL-1的肺癌細胞模型,采用免疫共沉淀方法獲得在細胞內(nèi)與DAL-1結(jié)合的蛋白質(zhì),經(jīng)SDS-PAGE變性電泳分離后,切取實驗組與空載體組的差異蛋白條帶經(jīng)MALDO-TOF/TOF質(zhì)譜檢測,分析DAL-1在蛋白水平對E-cadherin的影響。
　　結(jié)果:
　　一、重組質(zhì)粒pcDN

7、A3/DAL-1經(jīng)雙酶切證實插入片段大小與預期一致,測序結(jié)果顯示終止密碼子添加成功,擴增的目的片段完全匹配,成功構(gòu)建真核表達載體pcDNA3/DAL-1;經(jīng)RT-PCR、Western Blot檢測,證明DAL-1重組質(zhì)粒能在肺癌A549細胞中高效表達。
　　二、pcDNA3/DAL-1瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞48h后,熒光定量PCR及Western Blot方法檢測結(jié)果顯示:與空載體組相比,實驗組E-cadherin mRNA及蛋白

8、表達均顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而β-catenin、Vimentin、Fibronectin及Snail在mRNA及蛋白水平與空載體組相比,未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3/DAL-1后,熒光定量PCR及Western Blot檢測結(jié)果顯示:與空載體組相比,實驗組DAL-1表達顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。在穩(wěn)轉(zhuǎn)第3周,轉(zhuǎn)染細胞DAL-1表達達到平臺期,此時實驗組E-cadh

9、erin、β-catenin的mRNA及蛋白表達較空載體組顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P<0.05);Vimentin的mRNA及蛋白表達較空載體降低,組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05);而Fibronectin、Snail的mRNA及蛋白表達與空載體組相比,未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　四、成功擴增E-cadherin啟動子片段,經(jīng)雙酶切證實插入片段的大小及方向均與設計的一致,測序結(jié)果與Genbank比對顯示完全匹配,成功構(gòu)建

10、含E-cadherin啟動子片段的熒光素酶報告基因質(zhì)粒。采用雙熒光素酶報告基因方法檢測,實驗組較空載體組的E-cadherin啟動子活性顯著升高,組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　五、免疫共沉淀獲得細胞內(nèi)與DAL-1存在相互作用的蛋白,SDS-PAGE變性電泳后獲得差異蛋白條帶,經(jīng)MALDO-TOF/TOF質(zhì)譜檢測分別是4.1B、E-cadherin、HSPA5、P4HA1、β-tubulin,14-3-3ε蛋白結(jié)合。

11、>　　結(jié)論:
　　一、成功構(gòu)建DAL-1基因的真核表達載體pcDNA3/DAL-1,并證明其在肺癌A549細胞中能夠高效表達。
　　二、首次發(fā)現(xiàn)DAL-1通過上調(diào)E-cadherin、β-catenin表達,下調(diào)Vimentin表達,抑制EMT的發(fā)生。
　　三、DAL-1通過與E-cadherin的啟動子結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)E-cadherin的表達;DAL-1蛋白與E-cadherin蛋白結(jié)合,可能通過維持E-cad