尿路組織工程研究中不同部位來(lái)源脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較.pdf

1、目的：觀察、比較兔不同部位脂肪干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCS)在體外培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特性，評(píng)價(jià)不同來(lái)源部位是否與其生物學(xué)性能存在聯(lián)系，以便選取優(yōu)良的種子細(xì)胞用于下一步尿路組織工程研究，同時(shí)為深入研究ADSCS生長(zhǎng)特性具體的影響因素提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：應(yīng)用酶解法(I型膠原酶)分離出附睪附近、腹膜后、頸背部三個(gè)部位脂肪中的間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外傳代后差速貼壁培養(yǎng)純

2、化，比較不同培養(yǎng)方案的細(xì)胞狀態(tài)，觀察四代以后三個(gè)不同部位ADSCS的形態(tài)特征和生長(zhǎng)狀態(tài)，用鼠源性兔CD44分子的單克隆抗體做免疫細(xì)胞化學(xué)染色給予干細(xì)胞鑒定，對(duì)純化后的三部位第五代間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨、成肌多向誘導(dǎo)分化，采用“油紅O”染色法對(duì)成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞性質(zhì)進(jìn)行鑒定，VON KOSSA鈣染色法對(duì)成骨誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，RT-PCR法對(duì)成平滑肌誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行肌肉早期標(biāo)志物α-Actin基因的檢測(cè)，MTT法檢測(cè)差速貼壁培養(yǎng)后不同部位細(xì)胞的

3、生長(zhǎng)曲線和倍增時(shí)間并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和比較。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴兔三個(gè)部位脂肪組織顏色均為淡黃色；附睪附近脂肪較多且存有明顯脂肪外包膜，其它細(xì)胞成分污染機(jī)率較小。
　　 ⑵等量脂肪情況下，附睪附近和頸背部脂肪的原代ADSCS產(chǎn)量較多。
　　 ⑶三個(gè)部位ADSCS原代及傳代細(xì)胞形態(tài)：原代細(xì)胞形態(tài)較小，呈長(zhǎng)梭形或多邊性貼壁生長(zhǎng)；傳代后差速貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)增大，呈鋪路石樣分布，生長(zhǎng)、遷移活躍。
　　

4、⑷兔ADSCS標(biāo)志CD44分子免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性，分布處呈棕黃色顆粒沉淀。
　　 ⑸兔三個(gè)不同部位來(lái)源ADSCS多向誘導(dǎo)分化：誘脂分化后油紅染色可見(jiàn)紅色脂滴；誘骨分化后VON KOSSA鈣染色可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)物狀黑色鈣沉積；誘平滑肌六周后對(duì)照組α-Actin標(biāo)志物經(jīng)RT-PCR檢測(cè)顯示弱條帶，實(shí)驗(yàn)組則呈強(qiáng)條帶。
　　 ⑹兔三個(gè)部位ADSCS生長(zhǎng)曲線及倍增時(shí)間：頸背部和附睪附近來(lái)源ADSCS間的倍增時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P