聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　骨缺損的修復(fù)一直是骨科臨床亟待解決的難題之一。近年來(lái),隨著組織工程的空前發(fā)展,應(yīng)用組織工程化骨修復(fù)骨缺損成為了研究熱點(diǎn)。骨的再生是一個(gè)多因素相互作用的復(fù)雜過(guò)程,這一過(guò)程中,許多生長(zhǎng)因子發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)與成骨誘導(dǎo)有著密切的關(guān)系。BMP家族成員中,BMP2具有最高的成骨誘導(dǎo)活性,同時(shí),研究表明,BMP7可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和新骨形成

2、。因此,我們推測(cè)共表達(dá)BMP2和BMP7可能更有利于ADSCs細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的增殖,從而在體內(nèi)更好地促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)和愈合。
　　目的:
　　以人工合成β-TCP鈣磷陶瓷為支架材料,復(fù)合BMP2與BMP7聯(lián)合基因修飾的大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs),研究構(gòu)建組織工程骨的可行性。
　　方法:
　　(1)大鼠的脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)的分離

3、培養(yǎng)、體外擴(kuò)增,以及細(xì)胞表面標(biāo)志和分化潛能檢測(cè)。
　　(2)分別構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的BMP2重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及攜帶紅色熒光蛋白(RFP)的BMP7的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。以Lv-BMP2轉(zhuǎn)染ADSCs、Lv-BMP7轉(zhuǎn)染ADSCs和Lv-BMP2、Lv-BMP7共轉(zhuǎn)染ADSCs,另設(shè)未轉(zhuǎn)染ADSCs作為對(duì)照。并以RealtimePCR和Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中BMP2和BMP7基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況

4、。應(yīng)用Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后14天各組細(xì)胞骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)情況,并檢測(cè)各組堿性磷酸酶(ALP)的活性。
　　(3)體外培養(yǎng)BMP2與BMP7聯(lián)合基因修飾的ADSCs,并種植于β-TCP,進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)。使用Picogreen染料定量細(xì)胞中的雙鏈DNA,監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖過(guò)程。采用ALP定量檢測(cè)細(xì)胞在材料內(nèi)表達(dá)ALP的情況。并通過(guò)茜素紅染色、熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞與支架材料復(fù)合物的成骨活性。
　　(4

5、)建立大鼠股骨缺損模型,按分組將細(xì)胞與支架材料復(fù)合物回植于股骨缺損處,回植后2、4、6周時(shí)X光拍照,同時(shí)組織學(xué)觀察體內(nèi)成骨情況。
　　結(jié)果:
　　(1)分離的大鼠ADSCs在體外具有很強(qiáng)的增殖能力,表面抗原CD44、CD29表達(dá)呈陽(yáng)性,CD45、CD34、CD11b表達(dá)呈陰性,并具有向成骨和成脂細(xì)胞分化潛能。
　　(2)慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中BMP2和BMP7基因可以高效穩(wěn)定表達(dá)。骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原的表達(dá)明顯升高,

6、并且聯(lián)合轉(zhuǎn)染組最高。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組的ALP活性也明顯高于單轉(zhuǎn)組。
　　(3)ADSCs經(jīng)BMP基因修飾后,雙鏈DNA定量分析發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞在支架材料上生長(zhǎng)增殖良好。細(xì)胞接種到支架材料14天后,雙基因修飾組的ALP活性、鈣化以及ALP、OPN、OC基因表達(dá)均明顯高于單基因修飾組。
　　(4)裸鼠實(shí)驗(yàn)中,X光和組織學(xué)檢測(cè)顯示,BMP2和BMP7雙基因修飾組及單基因修飾組都有新骨形成,但雙基因修飾組的成骨面積多于單基因修飾組(P<0.0