細粒棘球絳蟲重組抗原Eg10應(yīng)用價值的評價.pdf

1、目的：以細粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型對細粒棘球絳蟲重組抗原Eg10應(yīng)用價值進行評價，并與天然抗原（HCF、原頭蚴）進行比對。 方法：⑴動物模型的建立：Balb/c小鼠35只，20只腹腔接種2000psc/只，10只心腔接種400psc/只，余者注射高壓滅菌1×PBS作為對照，建立細粒棘球蚴感染小鼠動物模型。⑵重組蛋白Eg10的制備：以人源細粒棘球蚴原頭蚴總RNA為模板，據(jù)Genbank檢索的Eg10基因片段序列設(shè)計一對引

2、物，通過RT-PCR擴增目的基因片段；將目的基因克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對重組基因進行測序；結(jié)果正確無誤后，再將目的基因亞克隆至pET28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，構(gòu)建細粒棘球蚴Eg10基因原核表達體系，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，反復(fù)凍融以確定表達產(chǎn)物的溶解性并利用Novagen His·Bind 純化試劑盒純化此蛋白并以此純化蛋白免疫ICR小鼠，通過ELISA檢測其免疫原性。⑶動物模型對Eg

3、10和天然抗原的評價：以Eg10和HCF作為抗原，通過ELISA檢測細粒棘球蚴感染小鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a及IgG3抗體水平的動態(tài)變化；通過WB檢測此血清能否識別Eg10及天然抗原中相應(yīng)的條帶。 結(jié)果：⑴接種6個月后處死所有小鼠，剖腹、剖胸檢查包囊生長情況，30只實驗鼠中有包囊長出者為19只(含中期死亡2只)，腹腔接種較心腔接種感染率高（85％：20％），雌鼠較雄鼠感染率高 (72％：50％)，但經(jīng)確切概率法

4、檢驗無論是腹腔接種與心腔接種還是雌鼠與雄鼠之間均沒有顯著性差異。所長包囊經(jīng)病理組織切片檢查證實為包蟲囊泡。⑵ Eg10/pET28a/BL21(DE3)plysS能夠誘導(dǎo)表達出一與Eg10基因理論推測蛋白分子量一致的31kDa 條帶，表達量約占菌體總蛋白的52％，反復(fù)凍融后確定此蛋白以不溶性的包涵體形式表達；小鼠免疫2w后，IgG抗體值開始增高，第6w達最高值，8w后開始下降。⑶細粒棘球蚴感染小鼠血清ELISA及WB結(jié)果提示：以HCF作

5、為包被抗原，特異性IgG抗體及其亞類都有不同程度的增高，在IgG亞類中以IgG1增高為主；以Eg10作為包被抗原，特異性IgG抗體自感染棘球蚴后持續(xù)增高，而其亞類IgG1、IgG2a、IgG3未見明顯增加，間接反應(yīng)IgG2b為主要增高的IgG亞類；此血清能識別重組蛋白Eg10及原頭蚴中相應(yīng)條帶。 結(jié)論：成功的制備了細粒棘球蚴繼發(fā)性感染Balb/c小鼠模型，經(jīng)腹腔接種原頭蚴動物死亡率低、包囊形成快；成功的克隆了Eg10基因并構(gòu)建