兩個(gè)不同致病類型小麥葉銹菌株差異表達(dá)分析及其分泌蛋白的篩選.pdf

1、小麥葉銹菌是小麥的重要病原物，防治由該菌引起的小麥葉銹病最有效、經(jīng)濟(jì)、安全的方法是培育抗病品種。開展對(duì)小麥葉銹菌致病性差異研究對(duì)于揭示小麥葉銹菌致病分子機(jī)制及揭示毒性易變區(qū)域，有效利用抗病基因具有重要意義。本試驗(yàn)采用兩種不同致病類型葉銹菌08-5-361-1(THTT)和09-12-284-1(THTS)，分別接種到感病小麥品種Thacher上，在吸器大量出現(xiàn)時(shí)提取接種小麥葉片總RNA，使用IlluminaSolexa(深圳華大基因公司

2、)平臺(tái)對(duì)兩個(gè)RNA樣品（樣品ID分別為Tc284_2和Tc361_1）進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序。利用生物信息學(xué)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，尋找候選效應(yīng)分泌蛋白，為今后分泌蛋白的研究及闡明小麥葉銹菌致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　獲得主要結(jié)果如下:
　　1、構(gòu)建了數(shù)字表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫:對(duì)接種葉銹菌小種08-5-361-1、09-12-284-1的Tc樣品測(cè)序，分別命名為數(shù)據(jù)庫Tc284_2和Tc361_1，以已有的數(shù)據(jù)庫Tc15_2為參考數(shù)據(jù)庫。樣品T

3、c284_2與參考數(shù)據(jù)庫比對(duì)得到Total BasePairs為353，131，779，TotalReads7,206,771,Total Mapped Reads為2,935,991(40.74％), Unique Match為2，375，423(32.96％)。Tc361_1與參考數(shù)據(jù)庫的比對(duì)得到Total BasePairs344，976，954，Total Reads7,040,346,Total Mapped Reads2,4

4、76,977(35.18％), Unique Match1，994，137(28.32％)。Tc284_2組裝得到19950 unigenes，Tc284_2注釋到KEGG的Unigenes有10593個(gè)。注釋到Blast nr的有19138個(gè)。注釋到GO數(shù)據(jù)庫，得到GOProcess條目的有3，296個(gè)，GO Function條目6，685個(gè)，GO Component條目的有5，633個(gè)。Tc361_1組裝得到19，806 unige

5、nes，Tc361_1注釋到KEGG的Unigenes有10,657個(gè)。注釋到Blast nr的有18，973個(gè)。注釋到GO數(shù)據(jù)庫，得到GO Process條目的有5，720個(gè)，GO Function條目6，739個(gè)，GO Component條目的有3，379個(gè)。
　　2、以樣品Tc361-1為處理組，以Tc284-2為對(duì)照組進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，共得到2784個(gè)差異基因（差異表達(dá)基因?yàn)镕DR≤0.001且倍數(shù)差異不低于2倍的基因

6、），其中1708個(gè)上調(diào)表達(dá)，涉及到MAPK信號(hào)途徑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、序列特異的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、小GTP酶介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA運(yùn)輸、基質(zhì)特異性跨膜運(yùn)輸活性、賴氨酸降解、核酸結(jié)合、鋅離子結(jié)合、天冬酰胺合成酶、谷氨酸水解活性、輔酶Q結(jié)合、GTP酶活性、ATP解旋酶活性、應(yīng)激反應(yīng)等功能。下調(diào)基因1076個(gè)，注釋到的功能包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白、分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶活性、質(zhì)子泵運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)陽離子活性的ATP酶、細(xì)胞壁完整性和應(yīng)激反應(yīng)組件、錯(cuò)誤折疊

7、蛋白的異化作用、細(xì)胞色素b5還原酶、Lon-ATP結(jié)構(gòu)類似物蛋白酶、絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶活性、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合、金屬離子結(jié)合蛋白。
　　3、運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)差異基因編碼的蛋白進(jìn)行分析，用signalP篩選得到199個(gè)含有信號(hào)肽的unigenes，用targetP篩選得到4個(gè)定位于線粒體的unigenes，用TMHMM篩選得到40個(gè)含有跨膜結(jié)構(gòu)域的unigenes。用big-PI預(yù)測(cè)到5個(gè)unigenes含有GPI錨修飾位點(diǎn)，排除

8、靶標(biāo)在線粒體的、含有跨膜結(jié)構(gòu)域的、含有GPI錨定位點(diǎn)的蛋白，確定差異表達(dá)的分泌蛋白共150個(gè)。其中相對(duì)于Tc284-2，Tc361-1有上調(diào)表達(dá)的分泌蛋白92個(gè)，有下調(diào)表達(dá)的58個(gè)。在Tc284-2中特異表達(dá)的分泌蛋白為Unigene11683_Tc15_2、Unigene11935_Tc15_2，在Tc361-1中特異表達(dá)分泌蛋白分別是CL4323.Contig1_Tc15_2、CL5606.Contig1_Tc15_2和Unigen

9、e26432_Tc15_2。這些分泌蛋白均為功能未知的蛋白。
　　4、在分泌蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用Pfam對(duì)蛋白骨架和功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到注釋的分泌蛋白有36個(gè)。剩余的114個(gè)分泌蛋白使用MEME軟件進(jìn)行de novo結(jié)構(gòu)篩選和預(yù)測(cè)，結(jié)果在15個(gè)分泌蛋白中預(yù)測(cè)到3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是motif1(YxxxxNKxDC)、motif2(Y[N/A]Y[T/D][H/A][C/A][S/H][T/Q][S/N][S/G][N/C]T[