小麥與葉銹菌互作過程中TaCDPKs的表達(dá)分析及TaCPK2互作蛋白的篩選.pdf

1、CDPK（Calmodulin-depended protein kinase），即鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶，作為一種重要的Ca2+信號受體廣泛參與植物體的各種生理生化過程。CDPKs包含四個保守性差異很大的功能區(qū)，從N端起依次為可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)及調(diào)控區(qū)。研究表明，CDPK可以作為植物受病原物侵染后觸發(fā)一系列抗病反應(yīng)的一項重要必要條件。因此，開展CDPK的研究對揭示植物抵抗病原菌侵染的機(jī)制具有重要意義。
　　本實驗室前期通過抑制

2、性差減雜交試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分TaCDPK基因在小麥?zhǔn)苋~銹菌侵染后表達(dá)量發(fā)生變化，預(yù)示著TaCDPK家族可能在小麥與葉銹菌互作過程中起作用。隨后以TaCPK2為研究對象進(jìn)行的RT-PCR及westem試驗初步證實，TaCPK2可能參與小麥抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;并通過酵母雙雜交篩選得到TaCPK2的互作蛋白序列，其中一個序列與sHSP（Small heat shock protein）具有高度同源性。
　　為進(jìn)一步研究TaCDP

3、Ks在小麥與葉銹菌互作過程中的作用，本試驗以小麥中的14個TaCDPK基因為研究對象，根據(jù)14個小麥TaCDPK基因序列分別設(shè)計特異引物，將小麥品種洛夫林10分別與葉銹菌生理小種260和165組成不親和組合與親和組合，在接菌后0h、4h、8h、12h、16h、24h、48h分別取樣，利用實時定量PCR技術(shù)檢測14個TaCDPK基因在小麥與葉銹菌互作過程中的表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14個TaCDPK基因的表達(dá)模式可分為四類:TaCPK1、TaC

4、PK2、TaCPK6、TaCPK7在不同組合中在葉銹菌侵染早期表達(dá)量均明顯升高，初步推測這4個基因可能在葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的基礎(chǔ)抗性表達(dá)過程中起正調(diào)控用;TaCPK3、TaCPK18、TaCPK19三個基因在不同組合中在葉銹菌侵染早期表達(dá)量均明顯下降，初步推測這3個基因可能在葉銹菌侵染小麥誘發(fā)的基礎(chǔ)抗性表達(dá)過程中起負(fù)調(diào)控用;而TaCPK5、TaCPK8、TaCPK9、TaCPK12、TaCPK13、TaCPK15六個基因的表達(dá)量在不同組

5、合中隨接種時間的延長變化不明顯;另外TaCPK4在兩種組合中前期表達(dá)量并無明顯差異，且表達(dá)趨勢相近，但是在接種后48h不親和組合表達(dá)量明顯升高，而親和組合的表達(dá)量基本沒有變化，初步推斷TaCPK4在小麥抗葉銹菌侵染的后期可能參與了由抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)誘發(fā)過程。在此基礎(chǔ)上，本試驗用TaCPK2激酶區(qū)構(gòu)建誘餌載體，與酵母雙雜交文庫Mating互作，篩選與TaCPK2相互作用的蛋白，得到了3個陽性克隆。經(jīng)測序分析，其中一個陽性克隆為Zea

6、 mays clone155847940S ribosomal protein S5 mRNA，complete cds，另一個陽性克隆是hypothetical protein TRIVR3_07388[Triticum urartu]，第三個測得序列的陽性克隆是sHSP（Small heat shock protein）。鑒于上述結(jié)果，利用酵母一對一共轉(zhuǎn)化將TaCPK2和sHSP共轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中驗證兩者間的相互作用，初步證實兩者間