6個(gè)小麥葉銹菌菌株差異表達(dá)譜分析及其候選效應(yīng)蛋白的篩選.pdf

1、小麥葉銹菌(Puccinia triticina，Pt)是一類高度專化的活體營(yíng)養(yǎng)型真菌，其引起的小麥葉銹病嚴(yán)重影響世界小麥安全生產(chǎn)。專性寄生真菌的特殊寄生結(jié)構(gòu)—吸器產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白在病原菌致病性和寄主抗病性研究中扮演著重要角色。小麥葉銹菌的致病機(jī)制研究對(duì)于有效防控小麥葉銹病具有重要意義，而開展效應(yīng)蛋白的研究對(duì)于揭示致病機(jī)制意義突出。因此，本試驗(yàn)在對(duì)6個(gè)不同毒力的小麥葉銹菌菌株09-12-284-1、09-19-727-1、08-5-11-

2、1、04-15-7、03-5-99和08-5-260-2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過表達(dá)差異基因分析、利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)篩選候選效應(yīng)蛋白，利用Pfam尋找功能結(jié)構(gòu)，查找已報(bào)道病原真菌效應(yīng)蛋白motif,利用MEME軟件分析候選效應(yīng)蛋白的未知保守結(jié)構(gòu)域。隨機(jī)克隆了部分致病相關(guān)基因的ORF序列，最后用半定量RT-PCR和qRT-PCR分析所克隆部分基因的表達(dá)模式，初步推斷其生物學(xué)功能，研究將推進(jìn)對(duì)小麥葉銹菌致病機(jī)制及其與寄主植物的互作機(jī)制的

3、研究進(jìn)程。
　　本試驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:
　　1、對(duì)6個(gè)不同毒力小麥葉銹菌菌株轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩對(duì)比，共獲得差異表達(dá)基因319004個(gè)次，顯著差異表達(dá)基因26531個(gè)次。每個(gè)比對(duì)組合的差異表達(dá)基因在21266左右，而顯著差異表達(dá)基因的數(shù)量平均為1768個(gè)，但不同組合間存在顯著差異。Tc727-VS-Tc11的顯著差異表達(dá)基因最多，為4334個(gè)，而Tc99-VS-Tc260的顯著差異表達(dá)基因最少，僅有47個(gè)。顯著差異表達(dá)基因的

4、功能主要涉及生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、生物負(fù)調(diào)控、生物正調(diào)控、生殖、復(fù)制、響應(yīng)機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、大分子復(fù)合物、細(xì)胞膜組分、各類細(xì)胞器、抗氧化作用、結(jié)合作用、催化作用、電子載體、酶、金屬伴侶、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子、核酸結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。但從各自比較組合中發(fā)現(xiàn)，在不同的功能類型中，涉及到的具體功能條目的數(shù)量和基因存在差異。
　　2、利用SignalP4.1，TargetP1.1，TMHMM2.0和EffectorP生物信息學(xué)

5、軟件組合層層篩選，步步縮小范圍預(yù)測(cè)effector。最后得到702個(gè)候選分泌蛋白，311個(gè)候選小麥葉銹菌效應(yīng)蛋白。
　　3、Pfam和在線軟件CD Search對(duì)候選效應(yīng)蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，得到95個(gè)含有保守結(jié)構(gòu)的效應(yīng)蛋白，主要包括一些熱激蛋白、類甜蛋白家族、糖苷水解酶家族、細(xì)胞色素P450、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及CFEM真菌致病相關(guān)結(jié)構(gòu)等。對(duì)未知結(jié)構(gòu)的候選效應(yīng)蛋白用Meme軟件分析，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的保守結(jié)構(gòu)域。
　　4、Perl軟

6、件搜索候選效應(yīng)蛋白，共找到121個(gè)基因含有已知效應(yīng)蛋白保守結(jié)構(gòu)，其中11個(gè)含有RxLR結(jié)構(gòu)域（卵菌），3個(gè)含有G[I/F/Y][A/L/S/T]R結(jié)構(gòu)域（亞麻銹菌），87個(gè)含有[Y/F/W]xC結(jié)構(gòu)域（白粉病菌），35個(gè)含有[L/I]xAR結(jié)構(gòu)域（稻瘟病菌），同時(shí)還預(yù)測(cè)到了3個(gè)新的保守基序，說明小麥葉銹菌中含有豐富的效應(yīng)蛋白保守基序。
　　5、成功克隆候選效應(yīng)蛋白基因14個(gè)，分別是Unigene4156(481 bp)、Unige

7、ne4204(391bp)、Unigene5212(451bp)、Unigene8006(550bp)、Unigene8382(383bp)、Unigene12160(508bp)、Unigene20419(775bp)、Unigene8119(759bp)、Unigene4298(778bp)、Unigene22481(235bp)、Unigene16325(370bp)、Unigene5071(659bp)、Unigene2873(

8、211bp)和Unigene23963(210bp)。這些基因均與小麥稈銹菌假定功能蛋白相似，主要參與細(xì)胞組成、分子功能及生物過程。
　　6、經(jīng)qRT-PCR定量結(jié)果分析得出:Unigene4204、Unigene20419、Unigene5071、Unigene23963和Unigene12160在小麥葉銹菌侵染的早期誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)這些基因可能是參與早期誘導(dǎo)、抑制寄主防御反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo);Unigene8006、Unigene81

9、19、Unigene8382、Unigene22481和Unigene4298在侵染的后期誘導(dǎo)表達(dá)，在吸器大量形成時(shí)候高表達(dá)，推測(cè)這些基因可能與吸器寄生、銹菌產(chǎn)孢有關(guān)，極有可能是由吸器分泌出的致病相關(guān)因子。
　　從轉(zhuǎn)錄組水平分析不同菌株的差異表達(dá)情況，可以揭示出不同菌株之間大量的差異表達(dá)基因，轉(zhuǎn)錄組分析是揭示差異表達(dá)基因的良好途徑。利用多種工具和分析方法可以從大量的表達(dá)基因中獲得候選的效應(yīng)蛋白，多種方法結(jié)合，層層篩選，特別是增加E