高脂飼養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌胰島素信號(hào)系統(tǒng)和胰島素敏感性的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 高脂飼養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌蛋白激酶B、底物AS160表達(dá)水平的調(diào)節(jié)及其在骨骼肌胰島素抵抗中的作用 目的：探討高脂飼養(yǎng)對(duì)大鼠胰島素敏感性的影響，觀察胰島素刺激的高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗大鼠骨骼肌蛋白激酶B(Akt/PKB)及其底物磷酸化AS160的表達(dá)水平，體脂含量變化及其意義；探討PPAR-γ受體激動(dòng)劑羅格列酮和AMPK激活劑二甲雙胍對(duì)高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗大鼠骨骼肌Akt及磷酸化AS160、GLUT4蛋白

2、表達(dá)水平的影響，研究二者對(duì)骨骼肌胰島素敏感性的作用機(jī)制。 方法：雄性Wistar大鼠分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)組大鼠均給予高脂飼料，即脂肪占總熱量比例為59％，主要為飽和脂肪酸的動(dòng)物脂肪。各組飼養(yǎng)12周，之后實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)為高脂組、羅格列酮組以劑量為3mg·kg<'-1>·d<'-1>和二二甲雙胍組300mg·kg<'-1>·d<'-1>分別灌胃干預(yù)8周，對(duì)照組仍然給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余組仍給高脂飲食。喂養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)大鼠

3、體重和血糖水平，空腹血漿胰島素和血脂水平，及葡萄糖耐量試驗(yàn)，測(cè)定內(nèi)臟脂肪含量，評(píng)估胰島素敏感性，測(cè)定骨骼肌葡萄糖攝取率。應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組肌肉組織Akt及其底物AS160信號(hào)分子表達(dá)變化，檢測(cè)各組肌肉組織GLUT4蛋白表達(dá)變化，研究PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮和AMPK-α激活劑二甲雙胍對(duì)高脂誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌胰島素抵抗的改善作用及其機(jī)制。 結(jié)論：高脂飲食可以誘導(dǎo)大鼠機(jī)體水平和骨骼肌水平的胰島素抵抗。高脂飲食誘導(dǎo)的

4、胰島素抵抗大鼠體脂進(jìn)行性增多可能降調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素信號(hào)通路中磷酸化Akt Ser473的表達(dá)水平，升高骨骼肌磷酸化AS160的表達(dá)水平，同時(shí)其骨骼肌細(xì)胞膜GLUT4蛋白水平較對(duì)照組顯著降低，從而減少葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗。本研究提示大鼠骨骼肌磷酸化Akt Ser473表達(dá)下調(diào)和大鼠骨骼肌磷酸化ASl60的表達(dá)上調(diào)可能是高脂誘導(dǎo)大鼠骨骼肌胰島素抵抗的下游機(jī)制。羅格列酮和二甲雙胍可能直接或間接通過調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素信號(hào)傳導(dǎo)即增加

5、骨骼肌胰島素信號(hào)通路中磷酸化Akt的表達(dá)，降低骨骼肌磷酸化AS160的表達(dá)而改善胰島素的敏感性。 第二部分 AS160與14-3-3蛋白在高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌細(xì)胞中相互作用 目的：探討在高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌內(nèi)胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(GLUT4)移位中，磷酸化AS160是否和14-3-3蛋白發(fā)生生理性的相互作用。 方法：高脂飼養(yǎng)(脂肪占總熱量比例為59％，以飽和脂肪酸為主)雄性Wi

6、star大鼠12周，喂養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)大鼠體重和血糖水平，空腹血漿胰島素和血脂水平，及葡萄糖耐量試驗(yàn)，測(cè)定內(nèi)臟脂肪含量，并行骨骼肌葡萄糖攝取試驗(yàn)評(píng)估大鼠胰島素敏感性。分離并提取胰島素抵抗大鼠骨骼肌制成肌細(xì)胞懸液，在同時(shí)設(shè)立普通小鼠IgG對(duì)照下，利用Agarose結(jié)合的微珠進(jìn)行免疫吸附AS160抗體，然后把細(xì)胞懸液與微珠混勻孵育，溶液中的AS160就被吸附到微珠上。去掉上清液后，再利用去污劑將吸附在微珠上的蛋白洗脫下來，應(yīng)用14-3-3蛋白抗體

7、和AS160的抗體結(jié)合檢測(cè)并分離這兩種蛋白，采取免疫共沉淀結(jié)合Westernblot技術(shù)研究AS160與14-3-3蛋白之間的關(guān)系。 結(jié)論：在胰島素刺激下長(zhǎng)期高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌細(xì)胞中，AS160與14-3-3蛋白存在生理性的相互作用，胰島素刺激可能增加ASl60與14-3-3蛋白的相互作用。 第三部分 大鼠骨骼肌UCP-3和GLUT4基因表達(dá)水平在高脂飼養(yǎng)大鼠骨骼肌胰島素抵抗發(fā)病中的作用 目的：探

8、討胰島素刺激的高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗(IR)大鼠骨骼肌解耦聯(lián)蛋白3(UCP-3)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-4(GLUT4)mRNA基因表達(dá)水平的改變，觀察高脂飼養(yǎng)IR大鼠骨骼肌內(nèi)甘油三酯(TG)含量改變及其意義；了解PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮和AMPK-α激活劑二甲雙胍對(duì)高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的IR大鼠骨骼肌UCP-3和GLUT4mRNA基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)和對(duì)IR的改善作用機(jī)制。 方法：雄性Wistar大鼠分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)組

9、大鼠均給予高脂飼料，即脂肪占總熱量比例為59％，主要為飽和脂肪酸的動(dòng)物脂肪。各組飼養(yǎng)12周，之后實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)為高脂組、羅格列酮組以劑量為3mgokg<'-1>·d<'-1>和二甲雙胍組300mgokg<'-1>·d<'-1>分別灌胃干預(yù)8周，對(duì)照組仍然給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余組仍給高脂飲食。喂養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)大鼠體重和血糖水平，空腹血漿胰島素和血脂水平，及葡萄糖耐量試驗(yàn)，測(cè)定內(nèi)臟脂肪含量，評(píng)估胰島素敏感性，測(cè)定骨骼肌葡萄糖攝取率。通過酶比色法測(cè)定各組

10、骨骼肌TG含量，冰凍切片油紅O染色法對(duì)骨骼肌染色。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)對(duì)照組、高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗組和應(yīng)用羅格列酮組和二甲雙胍組骨骼肌UCP-3mRNA和GLUT4mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)論：高脂飼養(yǎng)導(dǎo)致骨骼肌脂肪含量增加可能使骨骼肌UCP-3 mRNA和骨骼肌GLUT4mRNA表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致胰島素敏感性降低。羅格列酮和二甲雙胍可能部分通過減少骨骼肌TG含量，增加UCP-3 mRNA和GLUT4mRNA的表達(dá)減輕IR。