長(zhǎng)期飲酒對(duì)正常飲食和高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景： 胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一。隨著飲酒的日益普遍及生活方式的逐漸西方化，探討長(zhǎng)期飲酒伴或不伴高脂飲食對(duì)胰島素敏感性的影響及機(jī)制就顯得愈發(fā)重要，因?yàn)橄嚓P(guān)的研究結(jié)果必將成為指導(dǎo)人們建立良好生活方式及預(yù)防飲食相關(guān)疾病的重要依據(jù)。 觀(guān)察正常飲食及高脂飲食條件下，長(zhǎng)期飲酒對(duì)機(jī)體胰島素敏感性的影響及相關(guān)信號(hào)分子的變化；從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面，利用大鼠和人兩個(gè)種屬的成熟脂肪細(xì)胞，驗(yàn)證大鼠和人脂肪組織中AMPK/MEF

2、2/GLUT4信號(hào)通路的存在，闡述了酒精影響胰島素敏感性的可能機(jī)制。 具體探討了以下問(wèn)題： 1．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 1．1觀(guān)察長(zhǎng)期飲酒對(duì)正常飲食和高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響。 1．2觀(guān)察長(zhǎng)期飲酒對(duì)脂肪組織中AMPK、MEF2及GLUT4表達(dá)的影響。 1．3驗(yàn)證活體大鼠脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號(hào)通路的存在。 2．體外實(shí)驗(yàn)： 2．1觀(guān)察體內(nèi)主要游離脂肪酸--棕櫚酸存在或不

3、存在時(shí)，酒精對(duì)AMPK、MEF2及GLUT4表達(dá)的影響。 2．2驗(yàn)證大鼠和人類(lèi)成熟脂肪細(xì)胞中AMPK/MEF2/GLUT4信號(hào)通路的存在。 方法： 1．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．1觀(guān)察長(zhǎng)期飲酒對(duì)胰島素敏感性及相關(guān)信號(hào)分子的影響。 1．1．1動(dòng)物分組及喂養(yǎng)： 分組一：雄性Wistar大鼠36只，按體重隨機(jī)分為3組，每組12只，即對(duì)照組；大劑量飲酒組；小劑量飲酒組。酒精每日一次灌胃給予，喂養(yǎng)時(shí)間22

4、周。 分組二：雄性Wistar大鼠36只，按體重隨機(jī)分為3組，每組12只，即正常飲食組；高脂飲食組；高脂飲食加酒精組。酒精每日兩次灌胃給予，喂養(yǎng)時(shí)間22周。 1．1．2大鼠葡萄糖耐量及胰島素敏感性的評(píng)價(jià)：處死前3天行口服糖耐量試驗(yàn)，分別測(cè)定空腹血糖及糖負(fù)荷后30、60、120分鐘血糖，計(jì)算糖耐量曲線(xiàn)下面積，用以評(píng)價(jià)葡萄糖耐量。處死前抽取空腹血，檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素，并計(jì)算HOMA-IR指數(shù)，用以評(píng)價(jià)機(jī)體水平胰島素敏感

5、性。 1．1．3血漿酒精濃度、血清脂聯(lián)素及游離脂肪酸的檢測(cè)：大鼠處死時(shí)留取空腹血，干化學(xué)法檢測(cè)血漿酒精濃度。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清脂聯(lián)素及游離脂肪酸。 1．1．4酒精對(duì)脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響：分離附睪及腎周脂肪組織并稱(chēng)重，用以觀(guān)察內(nèi)臟脂肪變化。RT-PCR檢測(cè)附睪脂肪組織中AMPK的催化亞基AMPKα1和α2、MEF2兩個(gè)亞型MEF2A和MEF2D以及GLUT4的mRNA水平。Wes

6、tern blot檢測(cè)總AMPKα、磷酸化AMPKα、MEF2以及GLUT4的蛋白表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)GLUT4的蛋白水平。 1．2驗(yàn)證大鼠脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號(hào)通路的存在。 2．體外實(shí)驗(yàn)部分： 2．1成熟大鼠和人脂肪細(xì)胞的分離：取正常雄性Wistar大鼠的附睪脂肪組織及成年男性的大網(wǎng)膜脂肪組織，小心剔除可見(jiàn)血管，用1mg/ml的膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化，先后經(jīng)500μm、250μm尼龍篩過(guò)濾、800

7、g離心得到成熟脂肪細(xì)胞。 2．2細(xì)胞分組及處理：將細(xì)胞重懸后，種到10mm培養(yǎng)皿中，每皿細(xì)胞數(shù)為1×107。實(shí)驗(yàn)分組如下： 分組一：N組，正常對(duì)照組；A組，1mM AICAR；C組，20μM compound C； A+C組，AICAR與compound C共培養(yǎng)。 分組二：N組，正常對(duì)照組；E1組，100mM酒精；A組，1mM AICAR；E1+A組，100mM酒精與AICAR共培養(yǎng)。 分組三：N組，正

8、常對(duì)照組；P組，0．4mM棕櫚酸；E2組，20mM酒精；P+E2組，棕櫚酸與20mM酒精共培養(yǎng)；C組，20μM compound C；E2+C組，20mM酒精與compound C共培養(yǎng)。 2．3 AMPKα、MEF2以及GLUT4的檢測(cè)：RT-PCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞中GLUT4mRNA水平；Western blot檢測(cè)T-AMPKα、pAMPKα、MEF2以及GLUT4的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1．觀(guān)察酒精對(duì)胰島素敏感

9、性和脂肪組織中AMPK、MEF2及GLUT4表達(dá)的影響。 1．1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分： 1．1．1血漿酒精濃度 每同一次小劑量灌酒，血漿酒精濃度為4．44±0．6mg/dl，每日一次大劑量灌酒，血漿酒精濃度為87±24．9mg/dl，而每日兩次大劑量灌酒，血漿酒精濃度則僅為10．84±4．4mg/dl，表明血漿酒精濃度除與攝入酒精的總劑量有關(guān)外，還與攝入酒精的頻率有關(guān)。結(jié)合血漿酒精濃度、以往的研究及本研究的結(jié)果，我們推測(cè)

10、每日一次小劑量灌酒可能模擬了不飲酒或少量飲酒的效應(yīng)，而在日飲酒總量相同的情況下，每日一次灌酒可能模擬了大量飲酒的效應(yīng)，而每日兩次則模擬了適量飲酒的效應(yīng)。 1．1．2胰島素敏感性評(píng)價(jià)： 1．1．2在正常飲食情況下，酒精喂養(yǎng)22周后，與C組相比，H組和L組大鼠空腹血胰島素水平分別增加27．6-和13．1％，HOMA-IR指數(shù)分別增加32．3-和13．3％，表明長(zhǎng)期大劑量和小劑量飲酒均可降低機(jī)體胰島素敏感性，大劑量飲酒對(duì)胰島素

11、敏感性的影響尤為明顯。 1．1．2．2在高脂飲食情況下，與N組相比，HF組大鼠空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)分別增加28．1-、28．3-和69．8％。而與HF組比較，增加適量酒精攝入使空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)分別下降了7．8-，19．7-和28．2％。上述結(jié)果表明，高脂飲食可以誘發(fā)機(jī)體胰島素抵抗，而長(zhǎng)期適量飲酒能夠改善高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗。 1．1．3長(zhǎng)期飲酒對(duì)大鼠脂肪組織中AMPK、MEF2

12、、GLUT4表達(dá)的影響 1．1．3．1在正常飲食情況下，長(zhǎng)期大量和小量飲酒不影響AMPKα1和AMPKα2亞單位的mRNA水平，同時(shí)脂肪組織T-AMPKα的蛋白水平也沒(méi)有明顯改變，但H、L組大鼠脂肪組織中pAMPK的蛋白水平顯著降低，提示長(zhǎng)期攝入乙醇可抑制AMPK活化。與pAMPK變化一致，MEF2及GLUT4的轉(zhuǎn)錄和翻譯也明顯受抑，由于AMPK是MEF2的上游分子，而MEF2又是GLUT4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，因此，長(zhǎng)期飲酒降低脂肪

13、組織中GLUT4表達(dá)的機(jī)制很可能是抑制了AMPK的活化，進(jìn)而使MEF2的表達(dá)降低所致。 1．1．3．2長(zhǎng)期高脂飲食降低大鼠脂肪組織中AMPK的活化，進(jìn)而引起MEF2及GLUT4 mRNA及蛋白表達(dá)減少，而長(zhǎng)期適量酒精攝入則可以減輕高脂飲食對(duì)AMPK活化及MEF2表達(dá)的損害，從而增加GLUT4表達(dá)。 1．2體外實(shí)驗(yàn)部分 1．2．1為選擇酒精的最適體外作用濃度，我們觀(guān)察了酒精的量效關(guān)系，如下圖所示，20mM酒精使成熟

14、大鼠脂肪細(xì)胞中AMPK活化增加，而50、100、150mM酒精抑制AMPK活化，并且這種抑制作用隨劑量增加而增強(qiáng)。因此在第一部分實(shí)驗(yàn)中我們選擇100mM來(lái)模擬大量飲酒的效應(yīng)，第二部分中選擇了20mM來(lái)模擬適量飲酒的效應(yīng)。 1．2．2大劑量酒精處理抑制AMPK活化，減少M(fèi)EF及GLUT4表達(dá)：在離體大鼠和人類(lèi)成熟脂肪細(xì)胞中，100mM酒精顯著降低AMPK活化及MEF2和GLUT4的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，酒精可以直接抑制上述分子的

15、表達(dá)，而不是繼發(fā)于其他系統(tǒng)的損害。 1．2．3適量酒精處理減輕游離脂肪酸對(duì)AMPK、MEF2及GLUT4表達(dá)的抑制作用：用棕櫚酸處理離體大鼠成熟脂肪細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)AMPK的活化水平、MEF2和GLUT4的表達(dá)均顯著降低，當(dāng)與20mM的酒精共培養(yǎng)時(shí)，上述分子的表達(dá)得到改善，提示適當(dāng)濃度的酒精可以部分抵消游離脂肪酸對(duì)AMPK、MEF2、GLUT4表達(dá)的損害。 2．驗(yàn)證脂肪組織中AMPK/MEF2/GLUT4信號(hào)通路的存在

16、 2．1體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 將AICAR注入大鼠體內(nèi)可顯著增加脂肪組織AMPK的活化，進(jìn)而使MEF2及GLUT4表達(dá)增加，說(shuō)明活化的AMPK可以正向調(diào)節(jié)MEF2的表達(dá)，從而使GLUT4轉(zhuǎn)錄增加，最終導(dǎo)致GLUT4蛋白表達(dá)的增加。 2．2體外實(shí)驗(yàn) 在大鼠及人類(lèi)成熟脂肪細(xì)胞中，AICAR激活A(yù)MPK后，使MEF2和GLUT4的表達(dá)顯著增加。然而，如果用AMPK阻斷劑--Compound C預(yù)處理上述細(xì)胞，則觀(guān)察不到AICA

17、R對(duì)MEF2及GLUT4的激活作用，提示在大鼠和人類(lèi)的脂肪細(xì)胞中， MEF2和GLUT4確實(shí)受到AMPKα正向調(diào)節(jié)，即存在AMPKα/MEF2/GLUT4這一信號(hào)通路。 結(jié)論： 1、在大鼠和人類(lèi)成熟脂肪細(xì)胞中存在AMPK/MEF2/GLUT4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，AMPK正向調(diào)節(jié)MEF2及GLUT4的表達(dá)。 2、在正常飲食情況下，長(zhǎng)期小量及大量飲酒降低胰島素敏感性，脂肪組織中AMPK活化受抑，導(dǎo)致MEF2表達(dá)減少，引起G