菊芋果聚糖合成酶基因克隆與表達分析.pdf

菊芋(Helianthus tuberosusL.)，屬菊科向日葵屬，又名洋姜、鬼子姜，是一種多年宿根性草本植物，菊芋高1-3米，有塊狀的地下莖及纖維狀根。菊芋抗逆性好，果聚糖含量高。因此從菊芋中發(fā)掘果聚糖合成酶基因以及對其功能的分析對菊芋的耐旱機理研究和耐旱遺傳改良具有重要意義。本實驗以菊芋品種“青芋1號”為材料，分別克隆了果聚糖合成酶基因1-SST和1-FFT，通過實時熒光定量PCR對這兩個基因在不同程度干旱脅迫處理下的表達進行研究，并對1-SST和1-FFT進行原核表達，為下一步的轉(zhuǎn)基因奠定了基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下：
　　1-SST基因CDS長1985bp，編碼659個氨基酸，分子量為74.59kD，等電點為5.10，蛋白質(zhì)半衰期為7.2小時，為穩(wěn)定性蛋白，總平均親水性為-0.171，屬于親水性蛋白。序列同源性比對表明，菊芋1-SST與朝鮮薊、萵苣和菜薊等菊科作物的同源性分別為84％、83％、83％。進化樹分析結(jié)果表明菊芋1-SST與朝鮮薊1-SST遺傳距離最近。
　　1-FFT基因CDS長2025bp，編碼641個氨基酸，分子量為73.802kD，等電點為10.01，不穩(wěn)定系數(shù)為46.08，屬于不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性為-0.153表明1-FFT蛋白屬于親水性蛋白。序列同源性比對表明表明，菊芋1-FFT與維氏菊的同源性最高，為85％，進化樹分析顯示菊芋1-FFT與維氏菊1-FFT遺傳距離最近。
　　實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：1-SST和1-FFT在菊芋葉片、莖段、根、花及塊莖中均有表達，但在不同組織中的表達水平有顯著差異，1-SST和1-FFT基因在塊莖中的表達量最高。利用PEG6000模擬脅迫，結(jié)果表明，1-SST基因和在1-FFT基因不同脅迫時間均有表達，并存在顯著性差異，其中1-SST基因在48h時表達量最高，1-FFT基因在60h時表達量最高。
　　以pET30a為原核表達載體,分別與1-SST和1-FFT基因重組構(gòu)建了融合表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，進行誘導融合蛋白表達，結(jié)果表明1-SST和1-FFT均能在原核表達體系中正常表達。