果聚糖轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及功能分析.pdf

1、果聚糖是高等植物的一種儲(chǔ)藏性碳水化合物，定位于植物細(xì)胞的液泡中，其解聚釋放可降低組織水分冰點(diǎn)的游離果糖，起到液泡滲透緩沖劑和低溫防護(hù)劑的作用，可以增強(qiáng)植物的抗旱性和抗寒性。 本研究克隆了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖合酶的sacB基因，序列分析與Ebskamp公布的果聚糖合酶基因氨基酸序列同源性為100％，以PBI121為載體，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI-sacB，使sacB基因置于CaMV35s啟動(dòng)子調(diào)控

2、下。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因煙草試管苗長勢(shì)良好，移栽室外，隨著煙草的不斷長大，葉片出現(xiàn)明顯的黃斑及葉壞死現(xiàn)象。推測在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的sacB基因產(chǎn)物，干擾了植物正常的生理功能，造成果聚糖的有害積累。鑒于植物原本在液泡合成和積累果聚糖，本研究將sacB基因與甘薯sporamin基因定位于液泡的引導(dǎo)肽序列融合，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI-sp-sacB，使sacB基因的表達(dá)產(chǎn)物定向運(yùn)輸?shù)揭号葜?。通過遺傳轉(zhuǎn)化，得到正常生長

3、的轉(zhuǎn)基因煙草植株。 利用Trizol試劑盒提取洋蔥RNA，通過RT-PCR的方法，獲得洋蔥SST基因的CDNA序列。測序結(jié)果與GenBank公布的洋蔥SST基因氨基酸同源性為99％。利用組成型植物表達(dá)載體pBI121，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI-SST。將pBI-SST通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子鑒定和果聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的測定。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因煙草葡萄糖的含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草，說明克隆的果聚糖轉(zhuǎn)移酶的基因已經(jīng)成