甜瓜ACC合成酶和EIN3基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文甜瓜ACC合成酶和EIN3基因的克隆與表達(dá)研究姓名：李正國(guó)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：蔬菜學(xué)指導(dǎo)教師：劉佩瑛2000.4.1120min和240min：用50pMIAA處胖3h，6h；分別用10mMAOA[(aminooxy)aceticacid]，500uMCuCl2，100“MABA，50mMLiCI，50uMCHX(cycloheximides)處理6小時(shí)，以水處理作為對(duì)照。采用PCR擴(kuò)增、cDNA文庫(kù)篩選從甜

2、瓜成熟果實(shí)的eDNA文庫(kù)中分離了兩個(gè)甜瓜ACSeDNA克隆；通過PCR擴(kuò)增和PCR步移從甜瓜基因組DNA中克隆了甜瓜ACS3的DNA序列：通過PCR擴(kuò)增從甜瓜成熟果實(shí)反轉(zhuǎn)錄合成的eDNA中克隆了甜瓜E1N3基因。并利RTPCR方法對(duì)甜瓜ACSI、ACS3和EIN3基因的表達(dá)進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下：1通過對(duì)番茄、擬南芥等植物的ACC合成酶基因序列分析，在保守序列區(qū)設(shè)計(jì)了兩個(gè)簡(jiǎn)并引物，以網(wǎng)紋甜瓜成熟果實(shí)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得

3、了兩個(gè)擴(kuò)增片段，經(jīng)測(cè)序分析結(jié)果表明為ACC合成酶同源基因，兩個(gè)核苷酸序列帕J的同源性為71％。2以這兩個(gè)eDNA片段為探針，篩選甜瓜成熟果實(shí)的eDNA文庫(kù)，經(jīng)兩次篩選后，獲得了兩個(gè)全長(zhǎng)的eDNA克隆，分別為1708bp和1620bp，經(jīng)測(cè)序分析和與基因庫(kù)的已知序列比較結(jié)果表明，其中一個(gè)為甜瓜ACSl基因，另一一個(gè)是甜瓜中的ACS3同源基因。甜瓜pACS3克隆與筍瓜、黃瓜、番茄ACS3基因的同源性分別為765％、758％和746％。這兩個(gè)

4、eDNA克隆問的同源性為65％。3以甜瓜DNA為模板，以甜瓜ACS3克隆兩端的特異序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了甜瓜ACS3基因的DNA序列。Ji：進(jìn)一步以DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物，將甜瓜DNA分別經(jīng)Dral、EcoR5、Pvu1、Seal、Ssp1五種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，通過PCR步移，分別從Seal、Ssp1酶切的DNA11分離了甜瓜ACS3基因的DNA序列及啟動(dòng)子區(qū)域。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，甜瓜ACS3DNA克隆全長(zhǎng)3226

5、bp，由三個(gè)內(nèi)含子和四個(gè)外顯子構(gòu)成。外顯子長(zhǎng)度分別為150bp，132bp，162bp，900bp，總長(zhǎng)為1344bp，編碼‘448個(gè)氨基酸，與eDNA的氨基酸序列完今相同。5’端的非編碼區(qū)長(zhǎng)1296bp。內(nèi)含子主要集中于起始編碼區(qū)的5’端，與大多數(shù)植物r，分離的ACS基因的內(nèi)含子的數(shù)量、位置都十分相近。與Mil(i等分離的ACSl基因的DNA序列相比，缺少一個(gè)內(nèi)含子。4以甜瓜果實(shí)eDNA為模板，通過EIN3基因的簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增，從

6、甜瓜中獲得了擬南芥EIN3的同源基因的eDNA克隆。該克隆是由1864bp組成的開放閱讀框架，編碼621個(gè)氨基酸。經(jīng)同源性分析表明，與煙草TELl基因的同源性為78％，與擬南芥EIN3、EILl、EIL2和EIL3基因的同源性分別為76％、70％、48％和40％。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在該克隆的序列中也存在其它基因所具有五個(gè)堿。h氨基酸的富集區(qū)。5通過RT—PCR結(jié)合Southern雜交分析結(jié)果表明：甜瓜ACSl基因和ACS3基因的表達(dá)存在著不同的表