新株型水稻潛在姜烯合成酶基因的克隆、表達和序列分析.pdf

1、萜烯類化合物作為植物次生代謝產物中最大的一個家族，在自然界中廣泛分布。在植物、植食性昆蟲及天敵三者之間扮演著“信使”角色，能夠引起昆蟲行為和生理上的多種反應，是對昆蟲行為產生調控作用的一種重要因素。隨著基因工程技術的發(fā)展，對高等植物體內萜烯類化合物的次生代謝合成途徑及其相關合酶的研究日趨增多，多種生物體內大量萜類合酶被克隆并功能分析。本研究在利用頂空固相微萃取一氣相色譜一質譜聯用技術分析了水稻揮發(fā)性化學成分的基礎上，根據KOME數據庫中

2、的水稻cDNA信息設計引物，以水稻葉片cDNA為模板，經PCR獲得兩條萜烯合酶基因全長序列，并將克隆得到的基因在大腸桿菌BL21菌株中進行異源表達。另外從生物信息學角度，對所得基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列的結構特征、疏/親水性、二級結構、跨膜結構域、亞細胞定位、功能域和系統發(fā)育等方面進行了分析，為后續(xù)實驗提供理論參考。目前取得以下一些初步結果，(1)利用Hs-SPME-GC-MS技術，通過檢索NIST質譜庫，運用色譜峰面積歸一化

3、法對四個品種水稻IR68011、TZRO、SN89366和汕優(yōu)63的揮發(fā)性化學成分及相對含量的分析結果表明，其主要揮發(fā)性成分為直鏈烷烴類化合物(17種)和倍半萜烯類化合物(5種)，另外還有少量酯類(2種)、醇類(1種)和酮類(1種)。其中TZRO揮發(fā)物中的倍半萜烯類化合物的含量最為豐富，含有β-倍半水芹烯(3.25％)、α-姜烯(3.01％)、α-香檸檬烯(1.7％)、α-姜黃烯(1.57％)、β-紅沒藥烯(1.48％)，而IR6801

4、1含有其中的α-姜烯(6.82％)和α-姜黃烯(2.4％)兩種倍半萜烯，不過IR68011中的姜烯含量是TZRO中的兩倍之多。本研究沒有在水稻揮發(fā)物中檢測到單萜烯化合物。 (2)對KOME數據庫中水稻的cDNA信息進行BLAST搜索，并設計引物，抽提富含姜烯的水稻品系IR68011葉片的總RNA，通過RT-PCR擴增得到兩條潛在姜烯合酶基因序列ZISl和ZIS2，測序結果顯示其ORF分別為1800 bp和1515 bp，利用基因

5、融合表達系統將得到的基因在大腸桿菌BL21菌株中進行表達，并摸索優(yōu)化了原核表達條件，SDS-PAGE分析結果顯示，目的基因獲得了大量表達，不過絕大多數原核表達蛋白均以無活性的包涵體形式存在，對后續(xù)的蛋白種類鑒定和活性測定帶來了一定困難。 (3)生物信息學分析表明，ZISl和ZIS2有著極為相似的堿基組成比例，ZISl的A:G:T:C=30:22.78:26.56:20.67，ZIS2的A:G:T:C=30.89:22.84:27

6、.13:19:14，兩者中A+T的含量均相對較多。ZISl編碼599 aa，ZIS2編碼504 aa，同樣ZISl和ZIS2也有著相似的氨基酸組成比例，含量最為豐富的氨基酸為Leu，分別為10.18％和10.91％。 經分析，ZISl和ZIS2均為親水性蛋白，均無導肽序列和信號肽序列，由導肽和信號肽的分析結果可推斷，其對應的蛋白在細胞質中合成后，不進行轉運，而是留在細胞質基質中，直接與代謝底物作用?？缒^(qū)域分析結果顯示．ZISl

7、和ZIS2均不含跨膜區(qū)，這也對導肽和信號肽的推測結果進行了驗證，即二者在細胞質中合成后，不進行跨膜轉運，直接在細胞質基質中的特定部位發(fā)揮作用。氨基酸序列功能位點搜索結果顯示，ZISl含有3個N-糖基化位點，1個環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷相關的蛋白激酶磷酸化位點，7個蛋白激酶C磷酸化位點，8個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，4個N-肉豆蔻?；稽c，1個酰氨化位點；ZIS2含有1個N-糖基化位點，4個蛋白激酶C磷酸化位點，7個

8、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位點，2個N-肉豆蔻?；稽c，1個細胞附著位點。這些序列中功能位點的多樣性很好的說明了萜烯合酶功能的多樣性。對ZISl和ZIS2氨基酸序列的結構功能域分析，發(fā)現了兩個功能域，一個是N-terminal domain(PF01397)，該功能域屬于萜烯合酶家族(TPS)所有，另一個為萜烯合酶結合金屬離子的功能域(PF03936)。氨基酸序列的二級結構分析結果顯示，α-螺旋和不規(guī)則卷曲是最大量的結

9、構元件，在ZISl中分別占59.93％和28.21％，在ZIS2中分別占72.82％和18.65％，另外均有少量的β-轉角和延伸鏈。 從GenBank數據庫中下載了54條不同植物多種萜烯合酶的基因序列，對其進行序列比對，并進行系統發(fā)育分析，結果顯示ZISl和．ZIS2均含有萜烯合酶共有保守區(qū)DDXXD序列，并與單子葉植物水稻和玉米的倍半萜烯合酶的關系最為接近，同時結果也顯示，除個別序列外，總體上單萜烯合酶、倍半萜烯合酶和二萜烯合