武漢地區(qū)輪狀病毒的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的該次研究目的是了解武漢地區(qū)輪狀病毒性腹瀉的主要流行毒株,以及A組輪狀病毒的基因型和亞組的流行特征,并對B組輪狀病毒進(jìn)行基因序列分析,為確立我國輪狀病毒的主要流行株以及構(gòu)建有效的輪狀病毒疫苗奠定分子流行病學(xué)基礎(chǔ).方法利用共用的下游引物RVG9和6個(gè)A組輪狀病毒G基因型G1-4、G8和G9的特異性上游引物,建立一步多重RT-PCR方法檢測G基因型;利用引物Con2、Con3進(jìn)行第一輪RT-PCR,以5個(gè)P基因型P[6]、P[8]、P[9

2、]、P[4]和P[10]的特異性引物進(jìn)行第二輪PCR,建立多重巢式RT-PCR方法檢測P基因型.2002年11月-2003年10在武漢市兒童醫(yī)院腹瀉門診按系統(tǒng)抽樣方法收集5歲以下兒童腹瀉樣本,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢出輪狀病毒陽性樣本,進(jìn)行G、P基因分型和VP6亞組分析,不能分型樣本利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,并對其基因序列進(jìn)行分析.另外對2000年12月-2002年12月在武漢地區(qū)發(fā)現(xiàn)的兩例B組輪狀病毒,利用PCR擴(kuò)增其V

3、P7、NSP2和NSP5基因,并連接到克隆載體pUCm-T上,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞One-shot Top10F',提取轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pst Ⅰ酶切分析,篩選出陽性菌提取質(zhì)粒,對插入片段進(jìn)行了測序和核苷酸序列分析.結(jié)論該研究是首次對武漢地區(qū)輪狀病毒進(jìn)行了系統(tǒng)的分子流行病學(xué)分析,武漢地區(qū)存在A組和B組輪狀病毒,其中A組輪狀病毒以G3P[8]型為優(yōu)勢流行株,亞組以基因亞組3為主;B組輪狀病毒與ADRV起源相同,且在20年里變異很小,基