豬2型圓環(huán)病毒ELISA診斷方法及豬2型圓環(huán)病毒-偽狂犬病病毒二價基因工程疫苗研究.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的動物病毒之一，該病毒與豬的多種疾病綜合征有關，特別是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征，該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼白及黃疸等，病原學及血清學調查表明，該病在許多國家都廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。為了了解PCV2在我國的流行現(xiàn)狀以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防制，本研究對PCV2ELISA診斷方法及PCV2-PRV

2、二價基因工程疫苗進行了研究，主要研究內容如下： 1.PCV2ORF2基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達采用PCR方法從包含PCV2全基因組的重組質粒pT-PCV中擴增PCV2ORF2基因的完整編碼區(qū)，將其克隆到pMD18-T載體后，構建了重組質粒pTORF2，經序列測定證實，該基因未發(fā)生任何堿基突變。已有報道證實ORF2蛋白N端41aa是其在細胞內的核定位信號，為了克服全長ORF2基因在大腸桿菌中表達時表達量低或不表達的缺陷，我們

3、采用酶切方法截去了ORF2基因5’-端的部分核定位序列，并對截短后的ORF2片斷進行了表達。具體方法是用BalⅠ和SalⅠ雙酶切pTORF2，回收含ORF2基因的小片段，并將其插入pGEX-KG原核表達載體的SmaⅠ和SalⅠ位點之間，構建原核表達質粒pGEX-ORF2，將該質粒轉化E.coliBL21，經IPTG誘導后GST-ORF2融合蛋白得到了表達，大小與預期結果相符，且表達蛋白可與PCV2標準陽性血清反應，具有免疫學活性。

4、 2.PCV2ELISA診斷方法的建立及應用SDS-PAGE分析表明，GST-ORF2融合蛋白在細菌裂解液的上清及沉淀中均存在，但主要位于裂解液的上清中，因此我們采用兩種方法分別對沉淀和上清中的融合蛋白進行了提取。對于沉淀中的包涵體，我們選用十二烷基肌氨酸鈉(SKL)對包涵體進行溶解，并通過TE(pH8.0)透析復性獲得有活性的融合蛋白。對于上清中的可溶性蛋白，我們采用谷胱苷肽瓊脂糖凝膠進行純化，結果表明用該方法提取的融合蛋白純度很高

5、，但獲得量較低。 為了確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)，我們對GST-ORF2可溶性蛋白和包涵體蛋白分別進行了方陣滴定，結果表明可溶性蛋白與標準陰、陽性血清的非特異性反應較低，更適宜用作診斷抗原。但考慮到包涵體蛋白提取費用低，且在對陰、陽性血清進行稍高倍數(shù)稀釋時可以降低非特異性反應，從而達到與可溶性蛋白相當?shù)脑\斷效果，因此我們選用GST-ORF2包涵體蛋白為ELISA方法的包被抗原。按照方陣滴定確定的抗原最佳包被濃度(1.

6、23μg/mL)包被酶標板，建立PCV2ELISA診斷方法，并對其進行了特異性、重復性和穩(wěn)定性試驗，結果表明該方法特異性、重復性良好，且在4℃可以保存至少12個月。與PCV2間接免疫熒光試劑盒的對比試驗表明，二者的陽性符合率為90.3％，陰性符合率為94.4％，總符合率為91.8％，由此可見，二者的符合率較高。在此基礎上，我們用該ELISA方法對臨床送檢血清進行了檢測，結果表明送檢血清中PCV2陽性率很高，并且隨著豬體年齡的增長，PCV

7、2陽性率逐漸升高。 3.表達PCV2ORF1和ORF2基因的重組偽狂犬病病毒的構建將經PCR方法擴增的ORF2全基因插入到PRVgG-缺失通用轉移載體pgG-Uni的多克隆位點中，從而構建轉移質粒pgGORF2。然后再將該質粒與PRVTK-/gG-/LacZ+基因組共轉染IBRS-2細胞，病變后經空斑純化得到重組病毒TK-/gG-/ORF2+。同理，將ORF1及截去核定位序列的ORF2插入到gE-/gI-雙缺失通用轉移載體pIE

8、CMV的多克隆位點中，從而構建轉移質粒pIEORF1-ORF2，并與PRVTK-/gE-/LacZ+基因組共轉染IBRS-2細胞，病變后經空斑純化得到重組病毒TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+。通過Southernblotting鑒定重組病毒，并通過間接免疫熒光試驗或Westernblotting檢測重組病毒中外源基因的表達，結果表明重組病毒構建正確，且外源基因得到了正確表達。在此基礎上，我們對重組病毒的TCID50進行了測定

9、，結果表明外源基因的插入不影響重組病毒在IBRS-2細胞上的增殖。 4.PCV2-PRV二價基因工程疫苗對小鼠和斷奶仔豬的免疫原性試驗將重組病毒按疫苗生產程序制成疫苗，并研究二價基因工程疫苗對小鼠和斷奶仔豬的免疫原性試驗。小鼠試驗結果表明，TK-/gG-/ORF2+誘導的PRV中和抗體與其親本株TK-/gG-/LacZ+抗體水平相當，而TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+誘導的PRV中和抗體低于其親本株TK-/gE-/L

10、acZ+的抗體水平，但這兩種疫苗免疫鼠都能完全抵抗致死劑量PRV強毒的攻擊，具有與親本株疫苗相當?shù)拿庖弑Ｗo效果。對PCV2抗體檢測結果表明，兩種二價基因工程疫苗都只能誘導產生較低水平的ELISA抗體。在小鼠試驗的基礎上，我們開展了二價基因工程疫苗TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+對斷奶仔豬的免疫原性試驗。對PRV的檢測結果表明，TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+誘導的PRV中和抗體也低于PRV三缺失疫苗TK-/gE-