口蹄疫—偽狂犬病二價(jià)與口蹄疫—豬細(xì)小—偽狂犬病三價(jià)基因工程疫苗的研究.pdf

1、口蹄疫、豬細(xì)小病毒病與偽狂犬病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的三種重要傳染病，分別由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)、豬細(xì)小病毒(porcineparvovirus，PPV)、偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)引起。當(dāng)前豬細(xì)小病毒病和偽狂犬病等豬繁殖障礙性傳染病在我國很多豬場流行，造成大量死胎、流產(chǎn)及豬生產(chǎn)能力下降，危害嚴(yán)重?？谔阋邉t是人畜共患的急性、烈性傳染病，由于其傳染性極強(qiáng)，而

2、傳統(tǒng)滅活疫苗在生產(chǎn)使用過程中有滅活不徹底導(dǎo)致病毒逃逸工廠而發(fā)生口蹄疫的風(fēng)險(xiǎn)，因此口蹄疫基因工程疫苗的研究受到高度重視。 偽狂犬病病毒具有不感染人、基因組容量大、重組病毒遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)，適合改造成表達(dá)外源基因的活病毒表達(dá)載體，以偽狂犬病病毒基因缺失株為表達(dá)載體構(gòu)建基因工程疫苗，將其它病原的保護(hù)性抗原基因插入PRV基因缺失疫苗株中，就可構(gòu)建成二價(jià)或多價(jià)基因工程疫苗，從而在豬場疫病免疫中起到一針防多病的作用。 1.口蹄疫與偽狂

3、犬病二價(jià)基因工程疫苗的研究將口蹄疫病毒衣殼蛋白前體P1-2A基因和蛋白酶3C基因共同插入到重組載體pIECMV中，構(gòu)建重組偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體pIEP1-2A-3C。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pIEP1-2A-3C與偽狂犬病病毒基因缺失標(biāo)志疫苗株P(guān)RVTK-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染，構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重組偽狂犬病病毒TK-/gE-/P1-2A-3C，并用空斑篩選與PCR鑒定的方法純化重組病毒。進(jìn)行Westernb

4、lot鑒定和測定重組病毒在不同細(xì)胞上的增殖滴度，結(jié)果表明重組病毒構(gòu)建正確且外源基因獲得有效表達(dá)，其增殖滴度與親本株相比差異不明顯。遺傳穩(wěn)定性和安全性檢測表明重組病毒穩(wěn)定性、安全性良好，重組病毒免疫BALB/c小鼠后用ELISA檢測血清中FMDV抗體，并測定FMDV中和抗體效價(jià)，結(jié)果表明重組病毒可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，從而為偽狂犬病與口蹄疫二價(jià)基因工程疫苗的研制應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 2.口蹄疫—豬細(xì)小—偽狂犬病三價(jià)基因工程疫苗的研

5、究將口蹄疫病毒衣殼蛋白前體P1-2A基因和豬細(xì)小病毒VP2基因共同插入到重組載體pIECMV中，構(gòu)建重組偽狂犬病病毒轉(zhuǎn)移載體pIEP1-2A-VP2，經(jīng)PCR和酶切鑒定證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建正確且兩個(gè)表達(dá)框?yàn)榉聪虿迦?。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pIEP1-2A-VP2與偽狂犬病病毒基因缺失標(biāo)志疫苗株P(guān)RVTK-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染，構(gòu)建了共表達(dá)口蹄疫病毒P1-2A基因和細(xì)小病毒VP2基因的重組偽狂犬病病毒PRVTK-/gE-/P1-2A-VP

6、2，并用空斑篩選與PCR鑒定的方法純化重組病毒。對重組病毒進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果表明口蹄疫病毒P1-2A前體與豬細(xì)小病毒VP2蛋白均得到了有效表達(dá)，測定重組病毒在不同細(xì)胞上的增殖滴度，其增殖滴度與親本株相比差異不明顯。安全性檢測表明重組病毒安全性良好，重組病毒免疫BALB/c小鼠后經(jīng)FMDV、PPV、PRV的ELISA抗體檢測與血清中和效價(jià)測定，結(jié)果表明重組病毒可誘導(dǎo)小鼠對這三種病毒產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)。重組病毒免疫小鼠后進(jìn)