O型口蹄疫與偽狂犬病二價(jià)基因工程疫苗的研究.pdf

1、口蹄疫(FootandMouthDiseaseFMD)是由口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirusFMDV)引起的偶蹄動(dòng)物急性、熱性、高度接觸性傳染病，是危害畜牧業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，也是造成家畜及其產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易受阻的重要疾病，被國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)在國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生法典中列為18種A類(lèi)傳染病之一，近年又被列為重大跨國(guó)動(dòng)物疫病的全球消滅計(jì)劃及生物武器安全公約組織重點(diǎn)檢查對(duì)象。中國(guó)政府公布的《動(dòng)物

2、病原微生物分類(lèi)明錄》將口蹄疫病毒列為十種一類(lèi)動(dòng)物病原微生物之一。FMDV屬于小RNA病毒科(Picomaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，有七個(gè)血清型，分別為A、O、C、Asial和南非SAT1、SAT2、SAT3，每種血清型里又可分為許多亞型，不同血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù)力，其中O型口蹄疫分布最廣，在非洲、南亞、中東和南美許多國(guó)家廣泛分布，在我國(guó)的口蹄疫病例大多都是O型口蹄疫。免疫預(yù)防接種是控制乃至消滅口蹄疫的主要

3、措施，目前使用O型口蹄疫滅活疫苗預(yù)防該病，取得了一定的效果，但是仍需改進(jìn)。 本研究以偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)基因缺失株TK-/gE-/LacZ+為載體，融合表達(dá)具有免疫增強(qiáng)作用的牛皰疹病毒I型VP22基因和O型FMDV的主要抗原基因P1或P1/2A/3C，構(gòu)建了基因工程二價(jià)疫苗株，達(dá)到一針預(yù)防兩種疾病的目的。同時(shí)以pcDNA3.1(+)為載體構(gòu)建了DNA疫苗pcDNA-VP22-P1和pcDNA-

4、VP22-P1/2A/3C。用Balb/c小鼠模型比較了重組病毒TK-/gE-/VP22-P1、TK-/gE-/VP22-P1/2A/3C和DNA疫苗pcDNA-VF22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C及豬口蹄疫O型滅活疫苗的免疫效果。 1.牛皰疹病毒I型VP22基因、O型口蹄疫病毒P1和P1/2A/3C基因的克隆與序列分析為了將VP22基因分別與FMDV的P1基因和P1/2A/3C基因的5’端按照正確的閱讀框架融

5、合，首先設(shè)計(jì)一對(duì)分別含有HindIII和EcoRV酶切位點(diǎn)的上、下游引物，從含有牛皰疹病毒I型VP22基因的重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出不含終止密碼子的牛皰疹病毒I型VP22基因編碼區(qū)；再用分別含有EcoRV和XbaI酶切位點(diǎn)的上、下游引物，從含有O型FMDVP1基因和P1/2A/3C基因的重組質(zhì)粒中分別擴(kuò)增出不含起始密碼子的P1基因和P1/2A/3C基因；將擴(kuò)增的VP22基因、P1基因和P1/2A/3C基因，分別克隆到pMD18-T載體，獲得重組

6、質(zhì)粒pMD18-T-VP22、pMD18-T-P1和pMD18-T-P1/2A/3C。DNA測(cè)序結(jié)果表明，三個(gè)基因的序列與已經(jīng)公布的序列完全一致。 2.共表達(dá)牛皰疹病毒I型VP22基因和O型口蹄疫病毒主要免疫原性基因的DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫原性的效果用HindIII和EcoRV酶切pMD18-T-VP22后，凝膠回收VP22基因，并定向克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的HindIII和EcoRV酶切位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)

7、粒pcDNA-VP22；將pMD18-T-P1和pMD18-T-P1/2A/3C分別用EcoRV和XbaI酶切后凝膠回收，回收片段分別定向克隆到pcDNA-VP22的EcoRV和XbaI酶切位點(diǎn)之間，使其與VP22的3’端融合，分別獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C。然后用Balb/c小鼠模型評(píng)價(jià)了pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C兩種DNA疫苗及本實(shí)驗(yàn)室以

8、前構(gòu)建的不含VP22的DNA疫苗pcDNA-P1和pcDNA-P1/2A/3C的免疫效果。結(jié)果顯示，首免后14天和28天，四種DNA疫苗均產(chǎn)生了可以檢測(cè)到的FMDVELISA抗體和中和抗體；含VP22的DNA疫苗(pcDNA-VP22-P1、pcDNA-VP22-P1/2A/3C)的抗體水平在二免后顯著高于不含VP22的DNA疫苗(pcDNA-P1、pcDNA-P1/2A/3C)(P<0.05)；DNA疫苗與FMDV滅活疫苗聯(lián)合免疫的抗

9、體水平顯著高于DNA疫苗單獨(dú)免疫(P<0.05)，但與FMDV滅活疫苗單獨(dú)免疫沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FMDV滅活疫苗(P<0.05)。 3.共表達(dá)牛皰疹病毒I型VP22基因和O型口蹄疫病毒多抗原表位的重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及其免疫應(yīng)答利用通用轉(zhuǎn)移載體pIECMV，構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pIECMV-VP22-P1和pIECMV-VP22-P1/2A/3C。以PRVTK-

10、/gE-/LacZ+為親本株，分別構(gòu)建了融合表達(dá)VP22-P1和VP22-P1/2A/3C的重組病毒TK-/gE-/VP22-P1和TK-/gE-/VP22-P1/2A/3C，經(jīng)空斑純化、PCR和Southern雜交鑒定，獲得了純化的病毒。Westernb1ot證實(shí)VP22-P1和VP22-P1/2A/3C在重組偽狂犬病毒中得到表達(dá)。檢測(cè)了重組病毒的遺傳穩(wěn)定性和增殖滴度。用該重組病毒免疫Balb/c小鼠，并與親本株和O型口蹄疫滅活苗進(jìn)行

11、比較。結(jié)果顯示，無(wú)論是TK-/gE-/VP22-P1疫苗免疫組，還是TK-/gE-/VP22-P1/2A/3C疫苗免疫組，其FMDV的ELISA抗體水平均與FMDV滅活疫苗免疫組的抗體水平相當(dāng)，顯著不差異(P>0.05)，說(shuō)明利用偽狂犬病毒融合表達(dá)VP22-P1和VP22-P1/2A/3C能激發(fā)很好的免疫反應(yīng)。 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了融合表達(dá)牛皰疹病毒I型VP22基因與O型口蹄疫病毒P1基因或P1/2A/3C基因的DNA疫苗