抗人CD40單抗5C11抗原識別表位的初步研究.pdf

1、本課題以本所自行成功研制的鼠抗人CD40激發(fā)型單克隆抗體5C11為研究對象，借助計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)，利用抗原-抗體相互作用原理，計(jì)算機(jī)模擬得到抗原CD40與抗體5C11的主要結(jié)合位點(diǎn)，從而推測出抗體識別的抗原表位；結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的CD40-CD40L互相作用位點(diǎn)，通過定點(diǎn)突變技術(shù)、構(gòu)建突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，驗(yàn)證計(jì)算機(jī)模建結(jié)果的可靠性，從而確定抗體識別的抗原表位，對5C11抗體進(jìn)行人源化改造或研制抗人

2、CD40抗體臨床用藥具有理論和潛在的臨床意義。
　　 目的：通過計(jì)算機(jī)模擬與生物實(shí)驗(yàn)，初步確定本所研制的抗人CD40激發(fā)型單抗5C11識別的抗原表位。
　　 方法：利用InsightⅡ軟件分別模擬抗原、抗體結(jié)構(gòu)，以及搭建抗原抗體復(fù)合物模型，通過計(jì)算并推測抗體所識別的抗原表位。通過RT-PCR的方法分別獲得人野生型CD40(wtCD40)和70位突變(70muCD40)及114位突變(114muCD40)的全長基因，構(gòu)建重

3、組真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40并進(jìn)行鑒定；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入HEK293細(xì)胞；RT-PCR和FCM的方法鑒定重組表達(dá)載體；FCM、Western Blot法比較5C11分別與HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的結(jié)合。
　　 結(jié)果：(1)搭建合

4、理的抗原CD40胞外段與抗體5C11 Fv結(jié)構(gòu)的復(fù)合物模型。(2)酶切和測序結(jié)果均證實(shí)成功構(gòu)建3個真核表達(dá)載體；RT-PCR和FCM檢測結(jié)果表明，表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞。(3)FCM結(jié)果表明5C11與HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40結(jié)合較之與HEK293/wtCD40結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度有減弱的趨勢；Western blot檢測結(jié)果表明5C11僅識別HEK293/wtCD40，不識別HEK293

5、/70muCD40和HEK293/114muCD40。由此表明5C11識別HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40的能力降低。
　　 結(jié)論：預(yù)測5C11識別的抗原表位是15-17、23、43-56、68-80、85、87、100-115；成功構(gòu)建HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，證實(shí)人CD40序列的第70位蘇氨酸和第114位谷氨酸是