γδT細(xì)胞抗原識別機(jī)制研究—含γδTCR CDR3δ序列嵌合抗體的構(gòu)建及其抗原結(jié)合特異性和SARS相關(guān)冠狀病毒B細(xì)胞抗原表位的篩選.pdf

1、本論文分兩部分；第一部分為γδT細(xì)胞抗原識別機(jī)制的研究。γδT細(xì)胞認(rèn)為是天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁，廣泛地參與到抗感染免疫、腫瘤免疫和自身免疫等各個方面。但迄今為止，只有少數(shù)的γδT細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)所識別的配體被鑒定，γδTCR抗原識別的具體細(xì)節(jié)尚不清楚。對三種抗原受體的結(jié)構(gòu)和序列多樣性的研究結(jié)果提示，αβTCR、γδTCR和抗體的識別抗原特異性主要決定于其互補(bǔ)決定區(qū)(complementarityde

2、terminingregions，CDRs)；γδTCR在抗原識別上與αβTCR相差甚多而與抗體更類似，被認(rèn)為是以“抗體類似”的方式與抗原結(jié)合。γδTCR和抗體整體結(jié)構(gòu)比較以及δ鏈和抗體重鏈的CDR3長度和氨基酸多樣性的比較提示，γδTCR的δ鏈和抗體重鏈在識別抗原中的作用類似；CDR3δ是γδTCR與抗原結(jié)合的重要部位。 本課題組的前期工作證明，來源于卵巢癌的γδ腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumorinfiltratinglympho

3、cytes，TIL)δ鏈CDR3短肽OT3能特異性地結(jié)合腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞系及其蛋白提取物和應(yīng)激分子。 為了進(jìn)一步闡明γδTCR抗原識別的機(jī)制，本研究利用PCR搭橋技術(shù)，將抗體重鏈CDR3區(qū)用被OT3短肽的相應(yīng)基因序列來替換，構(gòu)建成嵌合抗體重鏈的重組基因片段，克隆到表達(dá)載體pHγ1中，轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；篩選并大量培養(yǎng)陽性表達(dá)細(xì)胞以獲得含γδTCRCDR3δ的嵌合抗體。利用流式細(xì)胞、激光共聚焦顯微鏡和表面等離子體共振(su

4、rfaceplasmonresonance，SPR)等技術(shù)對嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性進(jìn)行了研究，比較嵌合抗體與合成的OT3短肽在抗原識別特異性方面的差別，以闡明γδTCR抗原識別的機(jī)制及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。結(jié)果表明，含γδTCRCDR3δ的嵌合抗體可以與人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、HO8910和Hela等細(xì)胞及其蛋白提取物結(jié)合，與其他人類腫瘤細(xì)胞系及其蛋白提取物不結(jié)合或結(jié)合較弱，提示嵌合抗體的抗原結(jié)合性有不很嚴(yán)格的組織特異性，并有一定的腫瘤結(jié)合特

5、異性。SPR的結(jié)果表明，嵌合抗體可與熱休克蛋白60(Heatshockprotein，HSP)發(fā)生特異性結(jié)合。 同時，本研究結(jié)果表明含γδTCRδ鏈CDR3區(qū)(OT3)序列的嵌合抗體與合成的OT3肽在抗原識別特異性方面是一致的，而對應(yīng)激分子HSP60的結(jié)合強(qiáng)度比OT3肽要強(qiáng)。將OT3短肽替換了抗體重鏈的CDR3區(qū)之后，嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性是由OT3所決定的，從而證明了γδTCR的抗原識別是一種線性的識別，CDR3δ區(qū)決定了其

6、抗原識別的特異性。本研究的結(jié)果對于闡明γδTCR抗原識別機(jī)制提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對于進(jìn)一步理解γδT細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的作用和地位具有重要的意義。論文的第二部分為應(yīng)用合成重疊肽庫進(jìn)行SARS-CovB細(xì)胞抗原表位的篩選和鑒定。嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SevererAcuteRespiratorySyndrome，SARS)是本世紀(jì)出現(xiàn)的第一次嚴(yán)重的傳染性疾病，該疾病的特點(diǎn)(高傳染性和高死亡率)使它成為一種對全球公共健康的特殊威脅。在SARS

7、爆發(fā)期過后，所有的國家都必須對SARS的再度出現(xiàn)保持警惕，而且要保持快速檢測和應(yīng)對SARS卷土重來的能力。因此，開發(fā)一種有效的SARS疫苗或抗病毒藥物是十分必要的。本研究利用SARS恢復(fù)期病人的血清和包含SARS相關(guān)冠狀病毒(SARSassociatedcoronavirus，SARS-Cov)蛋白的合成重疊肽庫，對SARS-CovB細(xì)胞表位并進(jìn)行篩選和鑒定。 首先，我們根據(jù)SARS-CovBJ01毒株的核酸序列，合成了覆蓋SA

8、RS-Cov突刺蛋白(Spikeprotein，S蛋白)、膜蛋白(Membraneprotein，M蛋白)、外套膜蛋白(Envelopprotein，E蛋白)、核蛋白體蛋白(Nucleocapsidprotein，N蛋白)10肽的重疊肽庫，用酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)法篩選與SARS恢復(fù)期病人的血清反應(yīng)的表位。在此基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)、合成含多個表位的短肽并進(jìn)行交叉反應(yīng)性檢測。

9、對所得到的高交叉反應(yīng)性的陽性表位進(jìn)行了競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。并制備了抗陽性候選表位的多克隆抗體，驗(yàn)證該抗體與各候選表位肽以及SARS-Cov裂解物的結(jié)合和競爭結(jié)合能力。結(jié)果表明，經(jīng)過第一輪篩選，共有¨1條多肽與SARS恢復(fù)期病人的血清反應(yīng)，分布在S蛋白(99條)，N蛋白(9條)，M蛋白(2條)和E蛋白(1條)。重新設(shè)計(jì)、合成的23條多表位肽對42份病人血清的反應(yīng)結(jié)果顯示，S471-503、S602-625、S1164-1191、N67-76和N

10、367-389肽分別與30份、30份、28份、38份和32份SARS病人血清反應(yīng)。競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，游離的肽能夠抑制病人血清與相應(yīng)多表位合成肽的結(jié)合，并且也可以抑制病人血清與SARS-Cov裂解物的結(jié)合。制備的抗上述陽性候選表位肽的多克隆抗體可以與SARS-Cov裂解物結(jié)合，并且這種結(jié)合也可以被相應(yīng)的肽所抑制。其中S471-503能抑制SARS-Cov的受體血管張力素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-convertingenzyme2

11、，ACE2)與其受體結(jié)合區(qū)域(receptorbindingdomain，RBD)的結(jié)合，并在體外抑制SARS-Cov對Vero細(xì)胞的感染。 為了最大可能的篩選到SARS-Cov的B細(xì)胞表位，本研究應(yīng)用包含SARS-Cov主要結(jié)構(gòu)蛋白的合成重疊肽庫，進(jìn)行最精確的B細(xì)胞表位作圖，并根據(jù)表位作圖的結(jié)果重新組合、設(shè)計(jì)了多表位肽，進(jìn)行了交叉反應(yīng)性測試。共得到了5條高交叉反應(yīng)性的肽，其中S471-503對SARS-Cov感染Vero細(xì)胞有