抗人CD40單鏈抗體噬菌體展示文庫的構建及初步鑒定.pdf

1、分類號：R73051密級：學位類別：科學學位團專業(yè)學位口學校代碼：10062學號：2011602232學科門類：醫(yī)學又坪眚斜袁號碩士學位論文M【ASTER’SDISSERTATIoN論文題目：抗人CD40單鏈抗體噬菌體展示文庫的構建及初步鑒定TITLEConstructionanddetectionofantihumanCD40singlechainfrgmentvariablephagedisplaylibrary一一級學科：臨床醫(yī)學

2、二級學科：外科學普外論文作者：陸禮指導教師：李衛(wèi)東教授導師組成員：付蔚華主任醫(yī)師天津醫(yī)科大學研究生院二。一四年五月天津醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要目的：構建抗CD40單鏈抗體(singlechainFragmentvariable，ScFv)的噬菌體展示文庫并進行初步鑒定，為下一步獲取高親和力抗CD40單鏈抗體奠定基礎。方法：①人重組CD40蛋白頸背部皮膚皮下注射免疫BALB／c小鼠②提取免疫小鼠脾臟總RNA，采用反轉錄PCR(reve

3、rsetranscriptionPCR，RTPCR)方法獲取CD40抗體的重鏈可變區(qū)(HeavyVariable，VH)及輕鏈可變區(qū)(LightVariable，VL)基因序列。③重疊PCR(overlapPCROEPCR)的方法構建單鏈抗體序列全長④通過雙酶切及定向克隆技術將ScFv克隆入噬菌粒pCANTAB5E，構建重組質粒pCANTAB5EScFv⑤將構建質粒轉化大腸桿菌TGI，構建原核表達文庫。⑥使用M13K07輔助噬菌體拯救T

4、Gl文庫，進而構建CD40ScFv的噬菌體展示文庫。結果：①成功獲取免疫小鼠體內的VH、VL片段基因序列②重疊PCR構建單鏈抗體全長，凝膠電泳檢測條帶大小約750bp，條帶清晰獨立，證實ScFv拼接成功③構建的重組質粒pCANTAB5EScFv經跏，與NotI雙酶切鑒定，凝膠電泳于750bp、4200bp處可見兩條條帶，證實質粒構建成功。④使用輔助噬菌體M13K07侵染轉化重組質粒TGl，成功構建CD40ScFv的噬菌體展示文庫，菌液涂