尼妥珠單抗不同給藥時(shí)間對(duì)人肺腺癌A549、Calu-6細(xì)胞放射增敏作用的研究.pdf

1、目的:探討EGFR單克隆抗體尼妥珠單抗不同給藥時(shí)間聯(lián)合放射線對(duì)人肺腺癌A549、Calu-6細(xì)胞放射增敏效應(yīng)的影響,明確尼妥珠單抗聯(lián)合放療的最佳給藥時(shí)間,觀察兩種細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否存在差異并探討產(chǎn)生不同結(jié)果的可能因?yàn)椤?br>　　 方法:體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549、Calu-6細(xì)胞為研究對(duì)象。Western blot檢測(cè)兩種細(xì)胞系EGFR蛋白的表達(dá)。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,每種細(xì)胞系各自分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組:空白對(duì)照組(O組)、單用

2、尼妥珠單抗組(N組)、單獨(dú)照射組(R組)、照射前24小時(shí)給藥組(N→R組)、照射同時(shí)給藥組(NR組)、照射后24小時(shí)給藥組(R→N組)。噻唑藍(lán)(MTT)比色法分別檢測(cè)尼妥珠單抗對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制作用,計(jì)算各自的IC20和IC50值,選擇IC20值作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物干預(yù)濃度。克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)尼妥珠單抗不同時(shí)間給藥對(duì)兩種細(xì)胞放射增敏的作用并繪制細(xì)胞存活曲線。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)各組的細(xì)胞周期分布和凋亡指數(shù)變化。Western bl

3、ot檢測(cè)phospho-DNA-PK,Bcl-2,Bax,P21,Akt和pAkt蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.兩種細(xì)胞均存在EGFR蛋白表達(dá),但是表達(dá)水平存在差異。.A549細(xì)胞的表達(dá)水平較Calu-6細(xì)胞高。
　　 2.尼妥珠單抗對(duì)人肺腺癌A549、Calu-6細(xì)胞均具有增殖抑制作用,呈時(shí)間劑量依賴性,但對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用更明顯。尼妥珠單抗對(duì)A549細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的IC20分別

4、為(1.15±0.18)μg/ml、(0.84±0.05)μg/ml、(0.72±0.35)μg/ml；IC50為分別為(24.78±1.16)μg/ml、(11.08±0.30)μg/ml、(8.99±0.12)μg/ml。尼妥珠單抗對(duì)Calu-6細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的IC20分別為(2.45±0.32)μg/ml、(2.31±0.21)μg/ml、(1.06±0.08)μg/ml:IC50為(51.15±1.58)μg/

5、ml、(48.49±0.59)μg/ml、(36.41±0.85)μg/ml。
　　 3.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A549細(xì)胞N→R組、NR組、R→N組的SER分別為2.02、1.50、1.26。尼妥珠單抗無論何時(shí)給藥均增強(qiáng)了A549細(xì)胞的放射敏感性,但以N→R組的增強(qiáng)作用最為明顯。Calu-6細(xì)胞N→R組、NR組、R→N組的SER分別為1.88、1.09、0.97。尼妥珠單抗照射前24小時(shí)給藥使Calu-6細(xì)胞的放射敏感性明顯增

6、強(qiáng),照射同時(shí)給藥有輕度增強(qiáng)的作用,而照射后24小時(shí)給藥對(duì)Calu-6細(xì)胞的放射敏感性沒有影響。兩種細(xì)胞系N→R組的Dq、Do及N(細(xì)胞存活曲線的外推值)均明顯低于NR組、R→N組,照射前24小時(shí)給藥產(chǎn)生的放射增敏效應(yīng)最為明顯。
　　 4.細(xì)胞周期結(jié)果顯示:尼妥珠單抗作用于A549細(xì)胞可以使其G1/G0期比例明顯增加；與放射線聯(lián)合后,不論何時(shí)給藥均可使G2/M期比例增加,這種變化尤以N→R組的表現(xiàn)最為明顯。尼妥珠單抗作用于Calu

7、-6細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的G1/G0期阻滯；與放射線聯(lián)合后,僅N→R組可使G2/M期細(xì)胞比例增加。凋亡結(jié)果顯示,對(duì)于A549細(xì)胞,尼妥珠單抗不論何時(shí)給藥均可提高放射線誘導(dǎo)的凋亡,但N→R組的凋亡率最高。而對(duì)于Calu-6細(xì)胞,僅有N→R組提高了放射線誘導(dǎo)的凋亡,NR組、R→N組的凋亡率未見明顯改變。
　　 5.Western blot檢測(cè)結(jié)果,兩種細(xì)胞系的N→R組均顯示Bax、P21蛋白表達(dá)最高,而Bcl-2、Phospho-DNA-

8、PK.蛋白表達(dá)最低。Calu-6細(xì)胞的Akt、pAkt蛋白表達(dá)水平均高于A549細(xì)胞。兩種細(xì)胞系各自實(shí)驗(yàn)組之間的Akt蛋白表達(dá)水平無明顯差異。尼妥珠單抗能抑制 A549細(xì)胞的pAkt蛋白的表達(dá),而對(duì)Calu-6細(xì)胞無效:照射均能使兩種細(xì)胞的pAkt蛋白表達(dá)提高；與R組比較,兩種細(xì)胞N→R組的pAkt蛋白表達(dá)水平均減至最低。
　　 結(jié)論:尼妥珠單抗聯(lián)合照射的最佳給藥時(shí)間為照射前24小時(shí)。相同實(shí)驗(yàn)條件下,兩種細(xì)胞系的結(jié)果不同,這可能