人37LRP的克隆、表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf

1、層粘連蛋白(1aminin，LN)是細(xì)胞外基質(zhì)的一種重要的糖蛋白。細(xì)胞可通過(guò)不同的受體與LN結(jié)合，這些受體按結(jié)構(gòu)可分為整合素家族與非整合素家族兩大類。67KD的層粘連蛋白受體(67KDlamininreceptor,67LR)是整合素家族的一種，它廣泛存在于正常上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周圍神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及大部分腫瘤細(xì)胞的表面。繼67LR后，又發(fā)現(xiàn)了一種37KD的細(xì)胞質(zhì)蛋白。研究表明這種37KD的多肽是67LR日前體，稱為37I_RP(3

2、7-kDalamininreceptorprecursor,37LRP)。通過(guò)翻譯后加工，經(jīng)過(guò)酰基化后，依靠分子內(nèi)疏水作用，形成同聚或異二聚體，才轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓?7LR。此外，發(fā)現(xiàn)37LRP與核糖體結(jié)合蛋白有共同的序列，是同一蛋白，所以該蛋白也稱為37LRP/p40。雖然67LR已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)十幾年了，但它的分子結(jié)構(gòu)至今仍不清楚，37LRP是通過(guò)怎樣的機(jī)理轉(zhuǎn)變?yōu)?7LR到現(xiàn)在還沒(méi)有一致的結(jié)論。由于67LR與LN的相互作用在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重

3、要的作用，因此越來(lái)越受人們的重視。此外，LR還是許多病毒進(jìn)入細(xì)胞的受體，且37LRP在朊蛋白病的發(fā)病過(guò)程中起重要的作用。天然人37LBP蛋白含量少，提純困難。本課題旨在用原核表達(dá)的方法獲得人37LRP蛋白，以此蛋白為抗原制備LR抗體。本課題為整體性研究37LRP的結(jié)構(gòu)、功能提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和必要的技術(shù)支持。 目的構(gòu)建37LRP的大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒，并表達(dá)于BL21(DE3)中。表達(dá)的目的蛋白SDS-PAGE電泳分離純化后免

4、疫家兔，獲取人37LRP多克隆抗體。為進(jìn)一步研究37LRP的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。方法收獲培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，提取總RNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增37LRP的cDNA序列，將其克隆到PGEM-TEasy載體上，經(jīng)酶切測(cè)序鑒定正確后，再用PCR方法從重組質(zhì)粒PGEM-TEasy-LRP中擴(kuò)增出37LRP片斷，并克隆入pET22b(+)載體上，構(gòu)建表達(dá)載體pET-LRP。經(jīng)酶切測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化宿主菌BL2l(DE3)，在

5、IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳并鋅染后，獲取目的蛋白條帶，采用凝膠漂洗液洗脫目的蛋白。將純化后的目的蛋白作為抗原免疫健康大耳白兔兩只，采用ELISA檢測(cè)抗血清的效價(jià)。免疫印跡檢測(cè)抗血清的特異性。結(jié)果構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序并與GenBank比對(duì)，證明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有37LRP插入片段，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)37LRP蛋白。SDS-PAGE電泳分離目的蛋白目測(cè)純度達(dá)90％以上。ELISA檢測(cè)抗血清的效