ZIP激酶基因缺失在胃癌中的研究.pdf

1、胃癌是一種人類常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率位居腫瘤第四位。每年全球有70萬人死于胃癌，胃癌是引起腫瘤相關(guān)死亡的第二大殺手。我國為胃癌高發(fā)地區(qū)，主要分布在西北和沿海地區(qū)。目前胃癌的治療效果不理想，5年生存率小于20％。主要原因是就診時已到晚期；胃癌細胞對現(xiàn)有的化療藥物不敏感。因此深入研究胃癌的病因及發(fā)病機制，對胃癌的預(yù)防與治療有著迫切與重要的價值。 越來越多學者認為腫瘤是基因病，必須探明腫瘤發(fā)病的分子機制才能從根本上控制腫瘤的發(fā)

2、生和發(fā)展。胃癌的發(fā)生與發(fā)展與其它腫瘤一樣，是一個多因素作用、多基因參與、多階段發(fā)展的疾??；基因組不穩(wěn)定是其重要特征。基因組不穩(wěn)定在染色體水平表現(xiàn)染色體易位、擴增和缺失等；在核酸水平表現(xiàn)為基因的突變、基因缺失和擴增、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、表觀遺傳異常引起的基因沉默?；蚪M不穩(wěn)定引起癌基因激活、抑癌基因失活以及凋亡相關(guān)基因失衡等；細胞生長、增殖、分化和凋亡等過程的失調(diào)控。分子生物學和細胞遺傳學研究進一步證實胃癌的發(fā)生、演進是多種基因突變累積的結(jié)果，

3、其中癌基因激活及抑癌基因失活發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 基因擴增(geneamplification)是原癌基因激活的主要方式。原癌基因的擴增和過度表達為腫瘤細胞生長提供選擇優(yōu)勢，促進了腫瘤的發(fā)生與演進?；蛉笔?geneloss)是抑癌基因失活的重要方式。抑癌基因的缺失喪失了該基因在細胞周期、細胞增殖和細胞穩(wěn)定維持等多方面的調(diào)控功能，從而促進了腫瘤的發(fā)生。胃癌細胞系及胃癌組織中均存在著復(fù)雜的染色體改變，主要表現(xiàn)為腫瘤染色體特異部位的擴增

4、和缺失，導致了癌基因激活及抑癌基因失活。因此染色體高頻擴增區(qū)很可能存在癌基因并由于擴增而激活；而頻繁出現(xiàn)基因等位缺失的染色體區(qū)域可能存在著腫瘤抑癌基因并失活。所以從篩選和定位染色體特異區(qū)域的擴增和缺失入手，可以尋找、確定與胃癌相關(guān)的癌基因以及抑癌基因。 應(yīng)用CGH技術(shù)檢測不同發(fā)展階段的腫瘤染色體異常，不但可以了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，而且可為腫瘤的診斷和預(yù)后判斷提供遺傳標志。更為重要的是以CGH發(fā)現(xiàn)的染色體異常區(qū)域為基礎(chǔ)，可在

5、擴增或丟失的染色體區(qū)域中明確新的與腫瘤相關(guān)的癌基因或抑癌基因。我們課題組曾應(yīng)用CGH技術(shù)檢測了62例原發(fā)性胃癌染色體拷貝數(shù)的改變，結(jié)果顯示染色體高頻擴增的區(qū)域是8q、20q、13q、和3q；高頻缺失區(qū)域位于19p、17p、1p。進一步的分析發(fā)現(xiàn)19p缺失全部出現(xiàn)在印戒細胞癌中?；谝陨系慕Y(jié)果本研究應(yīng)用高分辨、高通量的比較基因組雜交微點陣(CGH-array)技術(shù)，設(shè)計獨特基因組DNA微點陣，包含650個人工細菌染色體克隆(BAC)，以精

6、確地定位胃癌腫瘤染色體異常的部位，挑選具有明確臨床病理意義的染色體異常區(qū)域，通過DNA熒光原位雜交(FISH)技術(shù)進行驗證。用蛋白印跡技術(shù)(westernblot)、組織微點陣(TMA)和免疫組織化學技術(shù)(IHC)檢測相關(guān)基因的蛋白表達的變化，分析其臨床意義。 本文的目的在于篩選、定位與胃癌相關(guān)的癌基因的擴增以及抑癌基因的缺失，結(jié)合相關(guān)基因的蛋白表達的變化，探討可能的致癌機制，為闡明胃癌的發(fā)生、發(fā)展機制提供研究基礎(chǔ)。全文共分為四

7、個部分： 一、比較基因組雜交微點陣(CGH-array)技術(shù)檢測胃癌分子遺傳學改變收集30例新鮮胃癌組織，包括癌組織和癌旁正常胃粘膜組織。提取基因組DNA，用隨機引物PCR的方法擴增樣本DNA和參考DNA，分別標記Cy3和Cy5于上述PCR產(chǎn)物上，與微點陣BAC克隆DNA進行雜交。用GenePix分析軟件分析Cy3:Cy5的比值，判斷染色體拷貝數(shù)的改變。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：有28例樣本獲得滿意結(jié)果。胃癌組織中染色體DNA擴增的頻

8、發(fā)區(qū)域依次出現(xiàn)于：16q21(53.6％)、19q13.1(42.9％)、5p15.4(32.1％)、3q26.3(28.6％)、3q21(25.0％)、13q14-13q21(25.0％)、13q21.1(25.0％)、3q13.3(21.4％)、19q13.1-13.2(21.4％)。缺失的頻發(fā)區(qū)域依次出現(xiàn)于：19q13.3(67.9％)、3q21(64.3％)、3p21(57.1％)、3p22(53.6％)、3p14(50.0％)

9、、13q21.33(39.3％)、5p15.3(35.7％)、16q24.3(35.7％)、19p13.3(35.7％)、13q31(28.6％)。10例出現(xiàn)19p13.3缺失，其中8例組織學類型為彌散型。該結(jié)果與我們以往研究一致，提示19p13.3可能包含著與胃癌發(fā)生有密切聯(lián)系的抑癌基因。 二、熒光原位雜交(FISH)驗證胃癌組織中染色體19p13.3缺失收集49例胃癌組織的石蠟切片，根據(jù)前面的CGH-array和CGH的結(jié)果

10、，選取染色體19p13.3的BAC克隆RP11-75H6為探針。BACDNA以紅色熒光標記，制備成熒光探針；在組織切片上進行間期核FISH雜交，熒光顯微鏡下觀察，每50個細胞中低于1個紅色信號就認為存在缺失。 結(jié)果如下：在49例胃癌樣本中有25例(51％)出現(xiàn)19p13.3的缺失。在32例組織學為彌散型胃癌中有17例存在19p13.3的缺失(53.1％)。而16例腸型胃癌中7例出現(xiàn)缺失(43.7％)。雖然差異沒有達到統(tǒng)計學的標準

11、，但我們看到19p13.3的缺失較易出現(xiàn)在彌散型中。胃癌中19p13.3的缺失是頻發(fā)事件，19p13.3的缺失與男性發(fā)病相關(guān)。該區(qū)可能存在某些抑癌基因與彌散型胃癌的組織學發(fā)生有內(nèi)在的聯(lián)系。BACRP11-75H6包含ZIP激酶基因該基因調(diào)節(jié)細胞的凋亡和自噬，與細胞的死亡密切相關(guān)，篩選此基因作進一步的研究。 三、蛋白印跡(WB)及免疫組化(ICH)檢測ZIP激酶蛋白在胃癌組織的表達收集新鮮胃癌組織27例，提取癌組織和癌旁正常組織蛋

12、白質(zhì)應(yīng)用westernblot檢測ZIPk的表達。 結(jié)果如下：27例癌旁組織均檢測到ZIPk蛋白的表達，腫瘤組織中有8例ZIPk蛋白表達減少，占29.6％。低分化腺癌中有5例，中分化腺癌中有2例，1例印戒細胞癌都出現(xiàn)明顯ZIPk表達減少。I期病例無ZIPk表達減少，II期有2例，IIIa期2例，IIIb期2例，IV期2例。晚期病例出現(xiàn)ZIPk表達減少的比例較中期高(44.4％：25％)，但統(tǒng)計學分析沒有性顯著差。 在胃癌

13、組織芯片上應(yīng)用免疫組織化學方法，檢測ZIP激酶編碼的蛋白在胃癌中的表達情況，并分析ZIP激酶表達異常與臨床病理的聯(lián)系，同時探討ZIP激酶表達異常對胃癌病人預(yù)后的影響。結(jié)果如下： 應(yīng)用免疫組化檢測161例癌組織和80例癌旁胃粘膜組織ZIP激酶基因的表達。有78例癌旁胃粘膜組織存在較強胞漿內(nèi)ZIP激酶基因的表達(97.5％)。50例胃癌腫瘤組織中有高水平的表達(28.5％)，27例低表達(16.8％)，84例弱或不表達(52.2)％

14、。 分析臨床病理資料顯示ZIP激酶的低或不表達與組織學類型相關(guān)(p<0.007)，其中17例印戒細胞癌中未發(fā)現(xiàn)ZIP激酶的表達，與彌散型組織學類型相關(guān)(p=0.045)。ZIP激酶的低或不表達與腫瘤的浸潤深度(p<0.001)、TMN分期(p<0.001)、腫瘤的轉(zhuǎn)移(p<0.001)密切相關(guān)。通過生存分析顯示正常ZIP激酶表達組5年生存率為62％，生存時間的中位數(shù)為71.5月。ZIP激酶低或不表達組5年生存率為37.8％，生存

15、時間的中位數(shù)為32.6月。Kaplan-Meier分析表明高表達組的總體生存時間和癌癥特異的生存時間均較低或不表達組長。log-rank(COX-Mantel)檢驗示差別具有統(tǒng)計學意義(p<0.001)。在COX模型中，單因素分析ZIP激酶低或不表達是影響胃癌病人長期生存的風險因素。在多因素分析中ZIP激酶的影響并不明顯，ZIP激酶并不是作為一個獨立因素影響胃癌病人的預(yù)后，而是通過影響腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移影響預(yù)后。 四、末端標記技術(shù)

16、(TUNEL)檢測不同ZIP激酶表達組胃癌腫瘤細胞的凋亡56例胃癌樣本根據(jù)免疫組化結(jié)果分為ZIP激酶高表達組(28例)和不表達組(28例)，應(yīng)用末端標記法顯示凋亡細胞。觀察500-1000個細胞，計算凋亡指數(shù)均數(shù)。 結(jié)果如下：ZIP激酶高表達組凋亡指數(shù)均數(shù)5.8±0.38％，不表達組凋亡指數(shù)均數(shù)1.8±0.379，差異具有顯著性(p<0.001)。 根據(jù)上述結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1.染色體16q21、19q1

17、3.1、5p15.4、3q26.3、3q21、13q14-13q21、13q21.1、3q13.3、19q13.1-13.2的擴增以及19q13.3、3q21、3p21、3p22、3p14、13q21.33、5p15.3、16q24.3、19p13.3、13q3的缺失是胃癌發(fā)展過程中的頻發(fā)事件，提示這些區(qū)域可能存在癌基因的擴增與抑癌基因的缺失，并與胃癌發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。 2.胃癌中19p13.3的缺失是頻發(fā)事件，19p13.3的缺