凋亡抑制基因Survivin在胃癌中異常表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分
　　目的:
　　1.通過優(yōu)化反應(yīng)體系,建立SYBR GreenⅠ染料real-time PCR檢測(cè)Survivin基因的方法。
　　2.驗(yàn)證二次導(dǎo)數(shù)最大值(SDM)法確定Ct值在實(shí)時(shí)定量熒光PCR中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.根據(jù)PCR產(chǎn)物熒光強(qiáng)度、循環(huán)閾值(Ct值)、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、相關(guān)系數(shù)和熔解曲線優(yōu)化反應(yīng)體系中各組分的量及反應(yīng)條件,并對(duì)引物二聚

2、體消除策略和Ct值獲取方式進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　2.根據(jù)SDM法確定Ct值不受熒光曲線基線影響的特性,建立一種不需核酸抽提步驟而直接利用血清快速定量檢測(cè)血清中乙肝DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR方法,用于驗(yàn)證其效能。由于蛋白質(zhì),膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯等不可避免地存在于血清中,可能對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾,因此按EP7-P方案對(duì)其進(jìn)行了抗干擾評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　1.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量熒光PCR體系擴(kuò)增Survivin的最佳組成

3、和條件是:Taq酶2.5U/100μl、MgCl22mmol/L、引物濃度0.2μmol/L和退火溫度58℃;在PCR循環(huán)延伸結(jié)束后設(shè)置一個(gè)低于特異產(chǎn)物Tm值2℃的熒光讀取溫度,能有效消除引物二聚體對(duì)定量檢測(cè)的影響。研究建立的SYBR GreenⅠ染料實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Survivin基因劑量方法的靈敏度為10拷貝/μl,線性范圍101~104拷貝/μl(r=0.9997),批內(nèi)變異系數(shù)(CV)1.13％~1.91%,批間CV3.31%

4、~4.50%。
　　2.在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)采用SDM法確定Ct值,不僅能克服了主觀因素所致重復(fù)性差的問題,同時(shí)還能在多種基質(zhì)效應(yīng)和熒光干擾物存在的情況下保證定量檢測(cè)結(jié)果的可靠性,應(yīng)被當(dāng)作實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定Ct值的首選方法。
　　結(jié)論:
　　1.優(yōu)化后的SYBR GreenⅠreal-time PCR具有方便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度較高和重復(fù)好等特性,適合于做Survivin基因劑量分析。
　　2.SDM法確定Ct

5、值法明顯優(yōu)于手工閾值法,適合于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。
　　第二部分
　　目的:
　　1.研究Survivin及其選擇性剪接變異體在胃癌中的表達(dá)及意義。
　　2.探討胃癌Survivin基因擴(kuò)增與表達(dá)以及臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。
　　3.建立限制性內(nèi)切酶依賴的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR方法,檢測(cè)胃癌組織Survivin外顯子1去甲基化狀態(tài),研究其與Survivin mRNA表達(dá)以及臨床病理參數(shù)之間的關(guān)

6、系。
　　4.探討Survivin基因啟動(dòng)子區(qū)域-31G→C多態(tài)性與胃癌發(fā)生及Survivin mRNA表達(dá)的關(guān)系。
　　方法:
　　1.建立SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法,結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù),對(duì)Survivin各種剪接變異體在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)還對(duì)Survivin各種剪接變異體表達(dá)水平和臨床病理資料作相關(guān)性分析。
　　2.建立一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Survivin基因

7、的方法,Survivin基因和內(nèi)參β2-MG基因的絕對(duì)含量通過參考DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得,以目的基因拷貝與看家基因拷貝數(shù)比值計(jì)算目的基因的相對(duì)拷貝數(shù),以腫瘤組織DNA相對(duì)拷貝數(shù)與正常組織DNA相對(duì)拷貝數(shù)比值>2.0判斷為腫瘤目的基因擴(kuò)增。
　　3.25例胃癌及與其配對(duì)的正常胃組織DNA經(jīng)甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶HpaⅡ和MspⅠ處理后用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)Survivin外顯子1進(jìn)行檢測(cè),Survivin mRNA

8、的表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)。
　　4.采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)檢測(cè)Survivin基因多態(tài)性,同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對(duì)腫瘤組織的Survivin mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.癌組織和癌旁組織均表達(dá)Survivin,并且得到免疫組織化學(xué)的證實(shí);Survivin-2B主要表達(dá)于癌旁組織,而Survivin-△EX3則主要在癌組織中被檢出;Su

9、rvivin-3B偶見于癌組織和癌旁組織中;Survivin-2a在癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性率為100%,但并不伴隨著Survivin在癌組織中升高。經(jīng)相關(guān)分析,Survivin-2a與總Survivin高度正相關(guān)(rs=0.4178,P=0.0018),而與Survivin-△EX3高度負(fù)相關(guān)(rs=-0.4506,P=0.0007),提示Survivin-2a可能作為非凋亡抑制因子,在腫瘤組織中對(duì)抗凋亡抑制因子。
　　2.胃癌

10、組織中Survivin基因的擴(kuò)增率為13.9%(6/43),擴(kuò)增倍數(shù)一般在2-10不等,發(fā)生擴(kuò)增的6例均高表達(dá)Survivin mRNA;腫塊≥5cm的胃癌組織Survivin基因擴(kuò)增率為33.3%,明顯高于腫塊<5cm的胃癌組織(6.5%的擴(kuò)增率),具有顯著差異(P﹤0.05);胃癌組織中Survivin基因擴(kuò)增與患者年齡、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期無(wú)相關(guān)性。
　　3.Survivin外顯子1去甲基化率在胃癌組織和癌旁組織分別

11、為96.0%(24/25)和20.0%(5/25)(2=29.639,p<0.001)。在25例胃癌組織中有22例(88.0%)發(fā)生Survivin mRNA過表達(dá),并且表達(dá)與去甲基化呈正相關(guān)(rs=0.5528,P=0.00416)。沒有發(fā)現(xiàn)去甲基化與年齡、性別、腫瘤大小、病理分級(jí)、臨床分期和轉(zhuǎn)移與否等病理參數(shù)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性(P>0.05)。
　　4.胃癌Survivin-31位C/C基因型頻率顯著高于對(duì)照組(基因頻率

12、0.396對(duì)0.119,2=18.89,P<0.005),-31C等位基因頻率也顯著高于對(duì)照組(等位基因頻率0.594對(duì)0.328,2=7.498,P<0.005)。胃癌組織高表達(dá)Survivin mRNA,但未發(fā)現(xiàn)Survivin-31基因型與Survivin mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1.Survivin不同變體表達(dá)之間的平衡關(guān)系可能對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起重要作用,其檢測(cè)對(duì)腫瘤早期診斷和腫瘤性質(zhì)判斷有一定