轉(zhuǎn)移抑制基因MTSS1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的研究.pdf

1、胃癌所具有的高轉(zhuǎn)移特性是該類型腫瘤預(yù)后較差的主要原因，深入探索其相關(guān)機(jī)制對(duì)提高患者生存率意義重大。候選基因MTSS1作為一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前研究認(rèn)為其通過影響細(xì)胞骨架的改變遷移等而與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。該基因在腫瘤中的研究目前尚是新的領(lǐng)域，迄今為止國內(nèi)外尚無有關(guān)于胃癌中的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究MTSS1在胃癌組織中多水平的表達(dá)情況及其與患者臨床病理的相關(guān)性，同時(shí)檢測MTSS1雜合性缺失的情況，以明確在腫瘤進(jìn)程中該基

2、因失活可能的機(jī)制。并在此基礎(chǔ)上深入研究MTSS1在體內(nèi)外對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的影響及其可能的機(jī)制。通過本課題的研究，可將MTSS1挖掘成為一種對(duì)于腫瘤的預(yù)后與轉(zhuǎn)移具有指示作用的新興標(biāo)志物以及阻斷胃癌轉(zhuǎn)移的可能靶點(diǎn)。
　　 第一部分，MTSS1在人胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系
　　 目的：研究MTSS1在人類胃癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理的相關(guān)性，以初步探討MTSS1在人類胃癌中表達(dá)的生物學(xué)意義。

3、r>　　 方法：在包含胃癌癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結(jié)或其他轉(zhuǎn)移灶的胃癌組織樣本1072例的組織芯片中，利用免疫組化、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平檢測MTSS1的表達(dá)。并結(jié)合臨床病理資料對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，探尋MTSS1在人胃癌中表達(dá)的臨床意義。
　　 結(jié)果：(1)胃癌組織及胃癌淋巴結(jié)或其他轉(zhuǎn)移組織中MTSS1蛋白表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)率較癌旁正常粘膜組織中明顯下降。MTSS1在胃癌原發(fā)灶組織中表達(dá)缺失率為70.

4、1％(751/1072)，在胃癌淋巴結(jié)及其他轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)缺失率達(dá)88％(103/117)。RT-PCR、Westernblot中結(jié)果趨勢(shì)也同上較一致。
　　 (2)MTSS1在胃癌中的表達(dá)與較多因素相關(guān)：隨著腫瘤分化程度向低或未分化進(jìn)展，MTSS1=的表達(dá)逐漸減少，故與腫瘤分化程度相關(guān)(P＜0.001)。另其與腫瘤大小(P=0.005)，腫瘤浸潤深度，組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均相關(guān)(P＜0.001)。
　　 (

5、3)MTSS1的表達(dá)與患者的生存期呈正相關(guān)，MTSS1表達(dá)下降或缺失的胃癌患者其預(yù)后較MTSS1表達(dá)陽性的患者明顯較差(18monthsvs76months；P＜0.001)。并且MTSS1與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等因素一樣，成為影響胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素之一。
　　 結(jié)論：MTSS1表達(dá)下降或缺失在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要作用，該基因與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，是一個(gè)潛在的判斷預(yù)后有效指標(biāo)。
　　 第二

6、部分，MTSS1在胃癌組織中表達(dá)缺失的相關(guān)機(jī)制研究
　　 目的：探討腫瘤轉(zhuǎn)移抑制候選基因(Metastasissuppressor1，MTSS1)在胃癌發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中的可能的分子機(jī)制。
　　 方法：運(yùn)用PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳.銀染法對(duì)含癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移灶的胃癌組織樣本各13例MTSS1基因位點(diǎn)上4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(D8S1832、D8S2132、D8S1179、D8S1461)進(jìn)行雜合性缺失

7、(lossofheterozygosity，LOH)檢測。
　　 結(jié)果：在MTSS1表達(dá)陰性的胃癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移組織中LOH發(fā)生率較高，總LOH率分別為46.15％和69.23％。
　　 結(jié)論：MTSS1基因位點(diǎn)頻繁的雜合性缺失可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中起到了一定的作用。
　　 第三部分，轉(zhuǎn)移抑制基因MTSS1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞學(xué)功能研究
　　 目的：應(yīng)用定向基因克隆技術(shù)，構(gòu)建MTSS1基因真核

8、表達(dá)載體pEGFP-N1-MTSS1，建立并鑒定能穩(wěn)定表達(dá)外源MTSS1基因的胃癌細(xì)胞系。通過基因雙向表達(dá)調(diào)控以研究MTSS1基因?qū)GS和MGc80-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的機(jī)理。
　　 方法：1、通過基因克隆技術(shù)獲得人MTSS1基因cDNA序列，將其克隆至T載體，測序正確后，經(jīng)酶切、回收并連接到真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N1，構(gòu)建pEGFP-N1-MTSS1表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定、測序正確后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEG

9、FP-N1-MTSS1表達(dá)載體和設(shè)計(jì)合成的干擾序列ShRNA431分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株AGS和MGc80-3細(xì)胞，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)率確定轉(zhuǎn)染效率，利用Realtime-PCR、免疫印跡法鑒定表達(dá)產(chǎn)物，紫外-可見分光光度法測定MTSS1活性的改變。
　　 2、以成功構(gòu)建的分別能穩(wěn)定表達(dá)外源pEGFP-N1-MTSS1，瞬轉(zhuǎn)ShRNA431，空載體pEGFP-N1/對(duì)照NC的胃癌細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)染的AGS/MGc80-3細(xì)胞為研究

10、對(duì)象，通過MTT比色、平板克隆集落形成、transwell小室侵襲遷移實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等一系列細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)及周期觀察，探索胃癌細(xì)胞株中MTSS1的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、周期、侵襲、遷移等的影響。
　　 結(jié)果：1、成功構(gòu)建了pEGFP-N1-MTSS1表達(dá)載體，經(jīng)鑒定顯示MTSS1在AGS細(xì)胞中過表達(dá)，活性測定證實(shí)轉(zhuǎn)染組的MTSS1活性較對(duì)照組明顯升高?；騇TSS1的過表達(dá)與干擾效率均較高。
　　 2、對(duì)轉(zhuǎn)染前后

11、的細(xì)胞觀察表明，重組體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長減慢，克隆形成率降低，對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲有所抑制。細(xì)胞周期檢測中MTSS1過表達(dá)組細(xì)胞被阻滯于G2/M期。裸鼠體內(nèi)成瘤也受到抑制。干擾組中盡管生長改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MTSS1干擾后細(xì)胞的遷移、侵襲以及體內(nèi)成瘤的能力均較對(duì)照組增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：本部分研究從體內(nèi)外揭示了基因MTSS1參與了調(diào)控人類胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為。MTSS1在對(duì)于影響胃癌患者的預(yù)后的相關(guān)事件中可能起