轉移抑制基因MTSS1在胃癌侵襲轉移中的研究.pdf

1、胃癌所具有的高轉移特性是該類型腫瘤預后較差的主要原因，深入探索其相關機制對提高患者生存率意義重大。候選基因MTSS1作為一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉移抑制基因，目前研究認為其通過影響細胞骨架的改變遷移等而與腫瘤的侵襲轉移相關聯(lián)。該基因在腫瘤中的研究目前尚是新的領域，迄今為止國內外尚無有關于胃癌中的實驗研究報道。本實驗擬研究MTSS1在胃癌組織中多水平的表達情況及其與患者臨床病理的相關性，同時檢測MTSS1雜合性缺失的情況，以明確在腫瘤進程中該基

2、因失活可能的機制。并在此基礎上深入研究MTSS1在體內外對胃癌細胞侵襲轉移生物學行為的影響及其可能的機制。通過本課題的研究，可將MTSS1挖掘成為一種對于腫瘤的預后與轉移具有指示作用的新興標志物以及阻斷胃癌轉移的可能靶點。
　　 第一部分，MTSS1在人胃癌組織中的表達與臨床病理特征及預后的關系
　　 目的：研究MTSS1在人類胃癌中的表達情況及其與臨床病理的相關性，以初步探討MTSS1在人類胃癌中表達的生物學意義。

3、r>　　 方法：在包含胃癌癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結或其他轉移灶的胃癌組織樣本1072例的組織芯片中，利用免疫組化、RT-PCR等實驗技術分別從mRNA水平和蛋白水平檢測MTSS1的表達。并結合臨床病理資料對實驗結果統(tǒng)計分析，探尋MTSS1在人胃癌中表達的臨床意義。
　　 結果：(1)胃癌組織及胃癌淋巴結或其他轉移組織中MTSS1蛋白表達強度和表達率較癌旁正常粘膜組織中明顯下降。MTSS1在胃癌原發(fā)灶組織中表達缺失率為70.

4、1％(751/1072)，在胃癌淋巴結及其他轉移灶中表達缺失率達88％(103/117)。RT-PCR、Westernblot中結果趨勢也同上較一致。
　　 (2)MTSS1在胃癌中的表達與較多因素相關：隨著腫瘤分化程度向低或未分化進展，MTSS1=的表達逐漸減少，故與腫瘤分化程度相關(P＜0.001)。另其與腫瘤大小(P=0.005)，腫瘤浸潤深度，組織類型、淋巴結轉移以及TNM分期均相關(P＜0.001)。
　　 (

5、3)MTSS1的表達與患者的生存期呈正相關，MTSS1表達下降或缺失的胃癌患者其預后較MTSS1表達陽性的患者明顯較差(18monthsvs76months；P＜0.001)。并且MTSS1與腫瘤浸潤、淋巴結轉移及TNM分期等因素一樣，成為影響胃癌患者的獨立預后因素之一。
　　 結論：MTSS1表達下降或缺失在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要作用，該基因與胃癌患者的預后密切相關，是一個潛在的判斷預后有效指標。
　　 第二

6、部分，MTSS1在胃癌組織中表達缺失的相關機制研究
　　 目的：探討腫瘤轉移抑制候選基因(Metastasissuppressor1，MTSS1)在胃癌發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉移中的可能的分子機制。
　　 方法：運用PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳.銀染法對含癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結轉移或轉移灶的胃癌組織樣本各13例MTSS1基因位點上4個微衛(wèi)星位點(D8S1832、D8S2132、D8S1179、D8S1461)進行雜合性缺失

7、(lossofheterozygosity，LOH)檢測。
　　 結果：在MTSS1表達陰性的胃癌原發(fā)及轉移組織中LOH發(fā)生率較高，總LOH率分別為46.15％和69.23％。
　　 結論：MTSS1基因位點頻繁的雜合性缺失可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉移中起到了一定的作用。
　　 第三部分，轉移抑制基因MTSS1在胃癌侵襲轉移中的細胞學功能研究
　　 目的：應用定向基因克隆技術，構建MTSS1基因真核

8、表達載體pEGFP-N1-MTSS1，建立并鑒定能穩(wěn)定表達外源MTSS1基因的胃癌細胞系。通過基因雙向表達調控以研究MTSS1基因對AGS和MGc80-3細胞生物學行為的影響及其可能的機理。
　　 方法：1、通過基因克隆技術獲得人MTSS1基因cDNA序列，將其克隆至T載體，測序正確后，經(jīng)酶切、回收并連接到真核細胞表達載體pEGFP-N1，構建pEGFP-N1-MTSS1表達載體，經(jīng)酶切鑒定、測序正確后，用脂質體轉染技術將pEG

9、FP-N1-MTSS1表達載體和設計合成的干擾序列ShRNA431分別轉染人胃癌細胞株AGS和MGc80-3細胞，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達率確定轉染效率，利用Realtime-PCR、免疫印跡法鑒定表達產物，紫外-可見分光光度法測定MTSS1活性的改變。
　　 2、以成功構建的分別能穩(wěn)定表達外源pEGFP-N1-MTSS1，瞬轉ShRNA431，空載體pEGFP-N1/對照NC的胃癌細胞系和未轉染的AGS/MGc80-3細胞為研究

10、對象，通過MTT比色、平板克隆集落形成、transwell小室侵襲遷移實驗以及裸鼠體內成瘤實驗等一系列細胞學功能實驗及周期觀察，探索胃癌細胞株中MTSS1的表達對腫瘤細胞增殖、周期、侵襲、遷移等的影響。
　　 結果：1、成功構建了pEGFP-N1-MTSS1表達載體，經(jīng)鑒定顯示MTSS1在AGS細胞中過表達，活性測定證實轉染組的MTSS1活性較對照組明顯升高。基因MTSS1的過表達與干擾效率均較高。
　　 2、對轉染前后

11、的細胞觀察表明，重組體轉染組細胞生長減慢，克隆形成率降低，對胃癌細胞的遷移、侵襲有所抑制。細胞周期檢測中MTSS1過表達組細胞被阻滯于G2/M期。裸鼠體內成瘤也受到抑制。干擾組中盡管生長改變差異無統(tǒng)計學意義，但MTSS1干擾后細胞的遷移、侵襲以及體內成瘤的能力均較對照組增強。
　　 結論：本部分研究從體內外揭示了基因MTSS1參與了調控人類胃癌細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為。MTSS1在對于影響胃癌患者的預后的相關事件中可能起