c-src激酶域基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)研究.pdf

1、c-Src蛋白是酪氨酸激酶(Tyrosineproteinkinase，TPK)的一種，屬于胞質(zhì)非受體類，現(xiàn)已被證明是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程中的一個(gè)重要的中介分子，通過與多種不同受體蛋白相互作用，在細(xì)胞生長、增殖、分化、運(yùn)動(dòng)和凋亡等生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。c-src基因在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在，并且在腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。 國內(nèi)外對(duì)c-Src蛋白的研究多集中于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路及細(xì)胞功能調(diào)

2、控的分子機(jī)制方面。關(guān)于c-Src的抑制劑的研究也漸成熱點(diǎn)。使用c-Src抑制劑對(duì)特定腫瘤的轉(zhuǎn)移有明顯作用，在臨床治療上具有廣闊前景。利用基因工程的方法大量表達(dá)c-Src蛋白，能夠大大提高c-Src抑制劑的篩選效率，同時(shí)為深入研究c-Src抑制劑的作用機(jī)制提供了可能。 本實(shí)驗(yàn)從已構(gòu)建好的pPROEXHTC/c-src質(zhì)粒中，使用PCR方法擴(kuò)增得到c-Src激酶域基因，與pUCm-T載體連接后，經(jīng)雙酶切與表達(dá)載體pET-22b(+)

3、重組，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選后，得到新的重組表達(dá)質(zhì)粒。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的產(chǎn)生，結(jié)合SDS-PAGE電泳檢測。通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳表達(dá)條件，并在此條件下進(jìn)行蛋白的大量表達(dá)。利用重組蛋白上帶有的組氨酸標(biāo)簽，采用對(duì)其具有特異性親和的Ni2+-NTA層析柱進(jìn)行分離純化，得到的高純度目的蛋白包涵體。將親和純化后的包涵體溶液過SephadexG-25凝膠柱進(jìn)行復(fù)性，對(duì)洗脫峰處的收集液，采用酶聯(lián)免疫吸附法，測定Src蛋白的酪氨酸激酶活性。 對(duì)轉(zhuǎn)化入

4、重組構(gòu)建的pET-22b(+)/c-src質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)蛋白的分子量與預(yù)期一致，為37.4KD，并通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳表達(dá)條件為30℃、0.1mmol/LIPTG、5h。大量表達(dá)目的蛋白并使用親和層析方法進(jìn)行純化。復(fù)性后的蛋白進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明宿主菌表達(dá)的Src蛋白基本沒有分泌到胞外，而是以包涵體的形式積累在胞內(nèi)，具有少量的酪氨酸激酶活性。由于表達(dá)的蛋白缺少N端的豆蔻酰域