16005.cyanothece51142染色體復(fù)制起始區(qū)的預(yù)測及驗證

1、Cyanothece51142染色體復(fù)制起始區(qū)的預(yù)測及驗證染色體復(fù)制起始區(qū)的預(yù)測及驗證IdentificationofaputativechromosomalreplicationiginfromCyanothece51142學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：胡耀中指導(dǎo)教師：黃鶴副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一三年六月I摘要Cyanothece51142是一種具有固氮作用的海洋藍(lán)細(xì)菌，在白天存在日光時進(jìn)行光合作用，而在晚上進(jìn)行固氮作用。2008年，

2、Welsh等報道了它的全基因組序列，但是進(jìn)行基因注釋時，用傳統(tǒng)的GCskew以及DnaAbox分析方法不能確定它的復(fù)制起始區(qū)，而未能標(biāo)注出復(fù)制起始區(qū)的基因序列。FengGao教授利用在線iC預(yù)測軟件iFinder對其環(huán)形和線性染色體的復(fù)制起始區(qū)進(jìn)行了預(yù)測，本課題對FengGao教授用iFinder預(yù)測的Cyanothece51142的染色體復(fù)制起始區(qū)的結(jié)果進(jìn)行了驗證，并得到了預(yù)期的實驗結(jié)果。首先，利用DNA重組技術(shù)得到包含環(huán)狀及線狀染色

3、體iC的克隆載體pEASYT1iC及pEASYT1iL，表達(dá)DnaA蛋白的表達(dá)載體pGEX4T1DnaA，表達(dá)DnaA(IV)蛋白的表達(dá)載體pET28aDnaA(IV)，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α、BL21及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建了基因工程菌DH5α(pEASYT1iCpEASYT1iL)，BL21(pGEX4T1DnaA)及BL21(DE3)(pET28aDnaA(IV))。其次，對BL21(pGEX4T1DnaA)及BL2

4、1(DE3)(pET28aDnaA(IV))的誘導(dǎo)條件經(jīng)過一系列優(yōu)化后確定了誘導(dǎo)表達(dá)條件，經(jīng)過GSTtag及Histag親和層析純化得到了DnaA(IV)蛋白并用于后續(xù)結(jié)合實驗的驗證。最后，進(jìn)行DnaA(IV)蛋白與Cyanothece51142環(huán)狀及線狀染色體的iC區(qū)的EMSA結(jié)合實驗驗證，驗證顯示實驗結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，證明DnaA(IV)蛋白能夠與預(yù)測的iC區(qū)呈現(xiàn)濃度依賴型結(jié)合，為iC區(qū)的軟件預(yù)測結(jié)果提供了實驗佐證，實驗結(jié)果顯示軟