藥學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文外文翻譯--高表達(dá)和純化的tat-hafgf19-154

1、<p><b>　　中文4912字</b></p><p><b>　　譯文：</b></p><p>　　高表達(dá)和純化的Tat-haFGF19-154</p><p>　　High-level expression and purification of Tat-haFGF19-154</p>&

2、lt;p>　　Yadong Huang, Yulan Rao, Chengli Feng, Yanmei Li, Xiaoping Wu, Zhijian Su,</p><p>　　Jian Xiao, Yechen Xiao, Wenke Feng, Xiaokun Li</p><p>　　摘要：人的酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在各種組織損傷后能夠刺激修復(fù)和再生中央和周?chē)窠?jīng),然而，

3、它不能穿過(guò)血腦屏障。為了生產(chǎn)具有細(xì)胞滲透性的治療性的酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，我們用Tat-PTD技術(shù)融合haFGF19-154基因。在這之后用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼序列，使pTathaFGF19-154-His在大腸桿菌BL21中得以表達(dá)。最佳表達(dá)的可溶性融合蛋白超過(guò)了總細(xì)胞蛋白的36.7%。Tat-haFGF19-154-His的重組體被具有Ni–NTA活性，葡聚糖凝膠G-25和肝素親和的色譜柱組合體純化95%。這數(shù)據(jù)用十二烷基硫酸鈉—聚

4、丙烯酰胺酰胺凝膠電泳檢測(cè)得到，最終產(chǎn)率為171 mg/l培養(yǎng)物。純化的Tat-haFGF19-154-His具有在Balb/c3T3細(xì)胞中不同的有絲分裂促進(jìn)活性，用MTT法測(cè)量它的半數(shù)有效量為3.931×10?4 μmol/l。Tat-haFGF19-154-His的蛋白以每劑量為10 mg/kg靜脈注射在大腦皮層和海馬中檢測(cè)得到。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Tat-PTD表

5、達(dá)；純化；有絲分裂促進(jìn)活性</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（haFGF）是一個(gè)有力的廣譜促細(xì)胞分裂劑。體外研究顯示酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源（Gimenez-Gallegoand Cuevas 1994）的影響?？咚沟仍?997年到1998年間發(fā)現(xiàn)，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子具

6、有內(nèi)分泌類(lèi)的活動(dòng)，可以作為一個(gè)血管擴(kuò)張，內(nèi)臟缺血的保護(hù)者，調(diào)節(jié)神經(jīng)。酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在神經(jīng)生長(zhǎng)和發(fā)展中起著舉足輕重的作用。以往的研究表明，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在海馬，紋狀體和下丘腦神經(jīng)細(xì)胞增殖的同時(shí)增強(qiáng)生存能力和刺激睫狀視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及刺激周邊神經(jīng)元。這是1988年立頓等人和1991維爾科克廝等人所證明的。haFGF能夠促進(jìn)神經(jīng)上皮細(xì)胞遷移和規(guī)范對(duì)腦神經(jīng)祖細(xì)胞的分化和促進(jìn)修復(fù)和再生有傷的中樞和外周神經(jīng)，之后還能營(yíng)養(yǎng)作用神經(jīng)元。這

7、是英杰和博恩在1992年及納曼在1996年所證明的。外源性的haFGF具有以衰減最初的毒物的可創(chuàng)性和持續(xù)時(shí)間來(lái)減輕海馬細(xì)胞的消亡和神經(jīng)元細(xì)胞的消亡 (Cuevas et al. 1994; Cuevas and Gimenez-Gallego 1996)。haFGF有效保護(hù)了由腦</p><p>　　在跨越血腦屏障（BBB）的治療性蛋白質(zhì)交付限制其規(guī)模和生物化學(xué)特性。具有154個(gè)氨基酸的haFGF蛋白質(zhì)，不能直接

8、穿過(guò)血腦屏障從循環(huán)，但可以通過(guò)腦內(nèi)注射入腦室(Li et al. 1998; Mufson et al. 1999)，滲透性開(kāi)放的血腦屏障(Rapoport 2000; Emerich et al. 2001)或病毒載體(Federoff et al.1992). 不過(guò)，腦內(nèi)注射可能會(huì)損害大腦組織，引起感染。開(kāi)放是選擇性滲透，不可能允許進(jìn)入大腦的其他物質(zhì)進(jìn)入?；蛑委熡薪?jīng)驗(yàn)的低效配置和較低的長(zhǎng)期蛋白的表達(dá)。因此，aFGF對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾

9、病的治療在臨床方面還受到嚴(yán)重的限制。</p><p>　　近年來(lái)，新的戰(zhàn)略已經(jīng)發(fā)展為加強(qiáng)血腦屏障的通透性(Schwarze et al. 1999;</p><p>　　Bayley 1999; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006)。一種方法是融合靶蛋白和穿膜肽細(xì)胞(CPPs)，如Tat-PTD，控制觸角基因的蛋白，單一的皰疹病毒-1VP22,卡波西氏的成

10、纖維生長(zhǎng)因子信號(hào)序列(Bayley 1999; Dietz et al. 2002)。Tat-PTD，來(lái)自艾滋病毒反式轉(zhuǎn)錄激活（TAT）獲得的9或11個(gè)氨基酸片段，與各種蛋白質(zhì)進(jìn)行融合后運(yùn)送到大腦(Elliott and O’Hare 1997)。到目前為止，幾個(gè)TAT融合蛋白，如PTD-Bcl-xL, PTD-GDNF, PTD-tyrosine hydroxylase,PTD-calpastatin, and PTD-SOD，已被證

11、明具有穿越血腦屏障的療效并有治療作用。在腦疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?Cao et al. 2002; Kilic et al. 2003; Sengoku et al. 2004; Kim et al.2005; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006; Wu et al. 2006).</p><p>　　這項(xiàng)研究中，我們對(duì)haFGF19-154和Tat-PTD 49-57與蛋白進(jìn)行融合后在大

12、腸桿菌中高效表達(dá)和純化成接近同質(zhì)。純化的融合蛋白具有明顯的促進(jìn)有絲分裂活性，并能夠跨越血腦屏障。</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p><b>　　試劑</b></p><p>　　限制性?xún)?nèi)切酶Nde I and BamH I購(gòu)買(mǎi)來(lái)自Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)；

13、標(biāo)準(zhǔn)haFGF(haFGF19-154)購(gòu)自廣州維佳（廣州,中國(guó)）；質(zhì)粒pET - haFGF19 - 154，表達(dá)載體pET3c和大腸桿菌菌株BL21（DE3）獲得來(lái)自生物醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)中心濟(jì)南大學(xué)；Ni-NTA瓊脂糖是從Invitrogen公司（美國(guó)）；CM–瓊脂糖和肝素-瓊脂糖由GE醫(yī)療保健公司(Piscataway, NJ, USA)；引物合成由上海生工（上海，中國(guó)）；兔抗多克隆抗體，從武漢博士德生物工程有限公司（武漢，中國(guó)）購(gòu)買(mǎi)

14、。</p><p>　　構(gòu)建Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His表達(dá)載體</p><p>　　這Tat-haFGF19-154-His互補(bǔ)DNA被放大由質(zhì)粒pET-haFGF19-154由標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)是由正向引物F1(5′-GGAATTCCATATGCGCAAAAAACGTCGTCAGCGTCGCCG</p><p>　

15、　TGCTAACTACAAG-3′) 和反向引物R(5′-GCAGATCTTTAGTGATGATGATGATGA</p><p>　　TGATCAGAAGAAACTGGCAA-3′)。正向引物F1和反向引物R分別包含NdeI and BglII 位點(diǎn)一種近似的465堿基擴(kuò)增片段被NdeI and BglII切斷然后再將其克隆到pET3c表達(dá)載體,這載體是先前已經(jīng)與被NdeI和BamHI酶切消化，建立相應(yīng)的表達(dá)載體

16、pTat-haFGF19-154-His。另一種表達(dá)載體pTat-haFGF19-154-His，它是通過(guò)相同的程序產(chǎn)生上述使用正向引物F2(5′-GGAATTCCATATGGCTAACTACAAGAAGCCAA</p><p>　　AGTTG-3′)和反向引物R.插入基因的精確度通過(guò)自動(dòng)化的DNA序列測(cè)定所證實(shí)的。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His and ha

17、FGF19-154-His的誘導(dǎo)和表達(dá)</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His被表達(dá)如下：?jiǎn)我晦D(zhuǎn)化菌落在4毫升中型的LB（10g蛋白胨,10g酵母提取物,5g氯化鈉溶入到1升的去離子水中）培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含100 μg/ml氨芐西林和1%葡萄糖且在37°C轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng).經(jīng)過(guò)隔夜培養(yǎng)，100μl的培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到50毫升新鮮的不包含葡萄

18、糖的LB培養(yǎng)基中,為了達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)，就是當(dāng)OD600值達(dá)到0.6，異丙基-D-半乳糖硫吡喃糖苷類(lèi)（IPTG)被增加到0.4 mmol/l終濃度。培養(yǎng)物培養(yǎng)在37°C和220轉(zhuǎn)動(dòng)6個(gè)小時(shí)Tat-haFGF19-154-His 和</p><p>　　haFGF19-154-His被十二烷基鈉硫酸鹽聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)，和他們表達(dá)水平被光密度計(jì)掃描器分析出來(lái)。為haFGF19-154-His達(dá)

19、到純化的目的,培養(yǎng)物被放大到1.0升的培養(yǎng)基里。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His的發(fā)酵</p><p>　　10微升種子菌株BL21（DE3）中有pTat-haFGF19-154-His表達(dá)質(zhì)粒，它是培養(yǎng)過(guò)夜的50毫升LB培養(yǎng)基中有100μg/ml氨芐青霉素（約12-14小時(shí);在220 rpm, 37°C下旋轉(zhuǎn)）。接著，10毫升的過(guò)夜培養(yǎng)基接種到新鮮的

20、200毫升LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中含有100μg/ml氨芐青霉素和在220 rpm, 37°C下?lián)u床培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到1.0，培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)5升發(fā)酵罐包含3升的LB培養(yǎng)基,在這之后OD600達(dá)到20。IPTG被增加到培養(yǎng)基中含有0.4 mmol/l.終濃度.誘導(dǎo)過(guò)程持續(xù)了5小時(shí),細(xì)胞通過(guò)離心5分鐘（時(shí)速為13,523×g在溫度為4°C）來(lái)收集。然后片狀樣的細(xì)胞被懸浮在20 mmol/l冰冷的包含5

21、mmol/l EDTA (PBS)緩沖溶液當(dāng)中。懸浮液在冰冷器中超聲處理然后離心30分鐘在轉(zhuǎn)速為30,427×g溫度為4°C。片狀沉淀物被清除，上清液被進(jìn)一步純化。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His的純化</p><p>　　細(xì)胞裂解物被用于一個(gè)勻稱(chēng)的Ni–NTA柱中含有20 mmol/l PBS buffer。用500毫升的洗滌劑緩沖溶液I

22、(20 mmol/l PBS containing 10 mmol/l imidazole and 150 mmol/l NaCl, pH8.0)清洗樹(shù)脂至到OD280價(jià)值達(dá)到基線。洗滌劑緩沖溶液II (20 mmol/l PBS containing 20 mmol/l imidazole and 150 mmol/l NaCl, pH 8.0)被適用于洗滌非特異性蛋白。最后，這個(gè)6xHis的標(biāo)記融合蛋白被洗脫液(20 mmol/l

23、PBS containing 300 mmol/l imidazole and additional 150 mmol/l NaCl, pH 8.0)清洗。這碎片包含了融合蛋白被用于一個(gè)Sephadex G-25均衡柱中含有0.6 mol/l 氯化鈉的20 mmol/l PBS buffer (pH 7.4)片段被混合，用一個(gè)勻稱(chēng)的heparin–Sepharose柱由上述的洗滌液來(lái)洗滌。凝結(jié)蛋白被含有1.2 mol/l 氯化鈉的20

24、</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His細(xì)胞增殖活性的分析</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His重組體的能力，他以加速對(duì)用（MTT）比色法對(duì)Balb/c 3T3細(xì)胞增殖來(lái)檢測(cè)計(jì)量。Balb/c 3T3細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化和用成96孔板（7,000 /孔）接種。細(xì)胞用RPMI 1640補(bǔ)充有10%胎牛血清，100 U/ml氨芐青霉素，和100

25、 U/ml鏈霉素在37°C下培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)和此后再在含有0.4%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。這些細(xì)胞比新鮮的培養(yǎng)基中含有不同Tat-haFGF19-154-His，haFGF19-154-His ，野生型haFGF的濃聚物。經(jīng)過(guò)24-48 小時(shí)的培養(yǎng)，細(xì)胞在100微克的每個(gè)MTT套管 中培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。該培養(yǎng)基被移除，然后150μl的二甲基亞砜加入到每孔。經(jīng)過(guò)30分鐘在室溫下孵化，存活細(xì)胞的數(shù)量立即通過(guò)測(cè)量在570 nm處的

26、吸光度來(lái)估計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次。</p><p><b>　　免疫組織化學(xué)分析</b></p><p>　　配制haFGF19-154-His (1 mg/ml) 和 Tat-haFGF19-154-His(1 mg/ml在 0.9% 鹽溶液)溶液，然后儲(chǔ)藏在零下20°C，總重105克的小鼠（雄的20±2克，廣東醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）分成3小組（每35克一

27、組）。兩組老鼠分別由尾靜脈注射入劑量為10 mg/kg aFGF19-154-His 和 Tat-haFGF19-154-His的溶液。第三組老鼠注射相同量0.9%的鹽溶液，老鼠被麻醉之后移除它們的大腦在30分鐘，1個(gè)小時(shí)，2個(gè)小時(shí)，4個(gè)小時(shí)，8個(gè)小時(shí)，12個(gè)小時(shí)和24個(gè)小時(shí)在服用藥物之后（5只老鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)）。腦組織固定在4％低聚甲醛溶液在4 ° C和用免疫組織化學(xué)分析。陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量在顯微鏡下能被計(jì)算出來(lái)。在顯微鏡下隨機(jī)挑

28、選十個(gè)視野，和在100個(gè)細(xì)胞中平均陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量來(lái)決定的。正染色的缺少被視作消極結(jié)果。</p><p>　　圖1. 圖解Tat-haFGF19-154-His和控制haFGF19-154-His融合蛋白</p><p>　　圖2. E.coli BL21(DE3)/ TAT-HA-aFGF14-154工程菌的發(fā)酵與純化</p><p><b>　　結(jié)果&

29、lt;/b></p><p>　　構(gòu)建和表達(dá)重組體Tat-haFGF19-154-His</p><p>　　haFGF的全長(zhǎng)由154氨基酸組成。即使N末端首位的氨基酸被刪除在穩(wěn)定性和生物學(xué)的haFGF形式上也沒(méi)有顯著的差別 (Luo et al. 1996; Imamura et al. 1990)。為了生產(chǎn)出具有細(xì)胞滲透性的haFGF19-154融合蛋白，一個(gè)具有Tat- haF

30、GF19-154-His的基因表達(dá)型載體被構(gòu)建，一個(gè)沒(méi)有Tat域重組質(zhì)粒也被做為構(gòu)建以此來(lái)對(duì)照（圖1）。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到中間對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)，包含Tat- haFGF19-154-His或者h(yuǎn)aFGF19-154-His的E. coli細(xì)胞在0.4 mmol/l IPTG的誘導(dǎo)下使兩個(gè)融合蛋白在溶液里表達(dá)(the ~17.3-kDa Tat- haFGF19-154-His and ~16.0-kDa haFGF19-154)。大約在5個(gè)小時(shí)誘

31、導(dǎo)之后總計(jì)表達(dá)重組體Tat- haFGF19-154-His占總細(xì)胞蛋白的36.7%（圖2）。</p><p>　　圖3. 用Ni-NTA親和色譜在E. coli表達(dá)的純化Tat-haFGF19-154-His。在Ni-TNA樹(shù)脂上應(yīng)用細(xì)胞裂解物，能被不同的咪唑和濃縮的氯化鈉泳道分子技術(shù)洗脫</p><p>　　純化和鑒定重組體Tat-haFGF19-154-His</p>

32、<p>　　在發(fā)酵之后，離心和溶解細(xì)胞并收集。細(xì)胞裂解物被用于一個(gè)Ni–NTA親和柱。</p><p>　　缺少6xHis標(biāo)記的蛋白質(zhì)用含10 和20 mmol/L咪唑的硫酸緩沖溶液的Ni–NTA樹(shù)脂，和包含TathaFGF19-154-His片段洗脫使用包含300 mM imidazole的PBS（圖3）。通過(guò)葡聚糖凝膠G-25和瓊脂糖–肝素的組合體親和色譜柱進(jìn)一步純化。Tat-haFGF19-15

33、4-His的純度比用光密度測(cè)定的95% 銀染SDS-PAGE 凝膠還要高（圖4）。表1是概述純化的結(jié)果。純化的Tat-haFGF19-154-His重組體的最終產(chǎn)率大約為171 mg/1的培養(yǎng)物。蛋白印跡法顯示純化的TathaFGF19-154-His和haFGF19-154-His是經(jīng)過(guò)6xHis的抗體驗(yàn)證的（圖4.）。</p><p>　　圖4 . SDS-PAGE和蛋白印跡分析的關(guān)于純化的TathaFGF

34、19-154-His和對(duì)照的haFGF19-154-His</p><p>　　融合蛋白。左側(cè)著銀色的是SDS-PAGE凝膠，右側(cè)是用抗-6xHIS抗體的蛋白印跡。利用泳道分子技術(shù)，第一泳道是純化的TathaFGF19-154-His，第二泳道是純化的haFGF19-154-His。</p><p>　　圖5 野生型haFGF、haFGF19-154-His和Tat-haFGF19-154

35、-His在Balb/c 3T3細(xì)胞上的促有絲分裂的影響。</p><p>　　表1. 對(duì)Tat-haFGF19-154 在E.coli中表達(dá)純化的綜述</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His重組體促進(jìn)有絲分裂活性</p><p>　　由MTT分析法得知，純化的Tat-haFGF19-154-His的促進(jìn)有絲分裂的活性比類(lèi)似的野生的haFGF19

36、-154-His低（圖5）。這個(gè)減少的合理解釋可能是部分Tat-haFGF19-154-His被Tat-PTD和不能互相影響在細(xì)胞表面的纖維母細(xì)胞受體直接陷入。這個(gè)機(jī)理的提出是通過(guò)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的功能。</p><p>　　圖6測(cè)定關(guān)于在在玻璃體內(nèi)大腦皮層和海馬的Tat-aFGF19-154-His。利用抗6xHis的抗體采用免疫組織化學(xué)的方法在玻璃瓶?jī)?nèi)對(duì)有aFGF19 - 154(a, c)和Tat-aFG

37、F19-154-His(b, d)的細(xì)胞給予八小時(shí)。紅色箭頭表示的是標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性染色。A和B代表海馬檢測(cè)。C和D代表大腦皮層檢測(cè)。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His 的融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腦</p><p>　　來(lái)測(cè)定純化的Tat-haFGF19-154-His 是否能夠通過(guò)血腦屏障，由尾靜脈單劑量10 mg/kg Tat-haFGF19-154-His注射入小老鼠。T

38、at-haFGF19-154-His融合蛋白在注射8小時(shí)之后用免疫組織化學(xué)法測(cè)定到分布在大腦皮層和海馬當(dāng)注射具有可控蛋白的haFGF19-154-His和生理鹽水時(shí)，沒(méi)有陽(yáng)性的免疫染色不是在海馬(圖6a)就是在大腦皮層（圖6c）中被找到。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　酸性成纖維因子是一的強(qiáng)大的促細(xì)胞分裂劑和有效的營(yíng)養(yǎng)因子。外源的酸性成

39、纖維因子已經(jīng)被證明可以在體內(nèi)預(yù)防許多大腦區(qū)域的神經(jīng)元退化和細(xì)胞凋亡(Date et al. 1990;Sasaki et al. 1992; Cuevas et al. 1994; Figueiredo et al.1995; Cuevas and Gimenez-Gallego 1996; Alexi et al.2000; Jankowsky and Patterson 2001).。血腦屏障不僅阻礙大腦藥物的發(fā)展，而且是限制神經(jīng)病

40、療法發(fā)展的最重要因素(Schwarze et al. 1999).一個(gè)穿膜肽細(xì)胞，Tat-PTD，被融合到各種目的蛋白上，這是一種已經(jīng)被廣泛使用的把藥物傳遞到大腦的方法(Cao et al. 2002; Kilic et al. 2003; Sengoku et al. 2004; Kim et al. 2005; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006;Wu et al. 2006)。在目前的研究中顯示T

41、athaFGF19-154的融合蛋白能夠在E. co</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His融合蛋白通過(guò)三步色譜層析法純化。Ni-TNA金屬親和層析技術(shù)可以用來(lái)從細(xì)胞裂解液中提取融合蛋白，經(jīng)Sephadex G-25柱除鹽和緩沖液洗脫后，使用肝素瓊脂糖凝膠對(duì)融合蛋白進(jìn)一步純化。經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，純化后的Tat-haFGF19-154-His融合蛋白純度高于95%。以往的研究表明，該融合蛋

42、白與可利用色譜法即羧甲基纖維-瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，但產(chǎn)率較低（wu et al.2005）。利用此提的純化產(chǎn)量為171 mg/l，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于使用傳統(tǒng)方法所獲得的產(chǎn)量（wu et al.2005）。</p><p>　　該融合蛋白有促分裂活性的產(chǎn)率比野生型的haFGF低。這可能是因?yàn)門(mén)at-PTD介導(dǎo)haFGF19-154直接內(nèi)化，使得haFGF19-154與細(xì)胞表面的受體相互作用減少，從而使得促有絲分裂途徑的信號(hào)傳

43、導(dǎo)減少。對(duì)沒(méi)有aFGF受體的COS-7細(xì)胞進(jìn)行促分裂活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Tat-haFGF19-154和haFGF19-154對(duì)COS-7細(xì)胞均沒(méi)有促增殖活性(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)，這表明細(xì)胞的增殖需要FGFR信號(hào)的激活（Wiedlocha et al.1996;Zalecki et al.1998）。</p><p>　　我們的數(shù)據(jù)表明，Tat-haFGF19-154-His蛋白在細(xì)胞核中分布最多。這種融合蛋白的分布取決于

44、核外序列Tat-PTD（甘氨酸，精氨酸，賴(lài)氨酸，賴(lài)氨酸，精氨酸）和haFGF（賴(lài)氨酸親-賴(lài)氨酸，亮氨酸）（Lozano et al.2000; Wu et al.2006）。越來(lái)越多證據(jù)表明，haFGF至細(xì)胞核的運(yùn)輸?shù)綄?duì)刺激DNA的合成是必需的，這可能有助于細(xì)胞的保護(hù)和促生長(zhǎng)（Lin et al.1996; Klingenberg et al.1998; Klingenberg et al.2000）。</p><p

45、>　　重要的是，我們這里系統(tǒng)的介紹構(gòu)建穿膜肽與haFGF19-154-His的融合蛋白，Tat-haFGF19-154 ，該融合蛋白能夠簡(jiǎn)單穿過(guò)血腦屏障。對(duì)于腦疾病治療的主要挑戰(zhàn)是如何克服治療大分子傳遞到大腦的屏障。雖然我們?nèi)匀灰獮檫@種治療作用和在神經(jīng)損傷和退化模式的重組融合蛋白進(jìn)行安全測(cè)試；但這種簡(jiǎn)單而有效的融合方法將擴(kuò)大生長(zhǎng)因子的治療作用。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn) </b&