甲型H1N1流感病毒特異性抗原捕獲ELISA方法的建立及通用型豬流感疫苗基礎(chǔ)研究.pdf

1、流感是人類面臨的主要公共健康問題之一。流感病毒在進化過程中發(fā)生導(dǎo)致抗原性改變的突變(抗原漂移)或不同流感病毒之間發(fā)生基因重配而產(chǎn)生一種新的流感病毒(抗原轉(zhuǎn)變)是其逃避宿主免疫系統(tǒng)、得以在感染群體之間傳播的主要策略。2009年開始流行的豬源新型H1N1流感病毒(以下簡稱甲流病毒)導(dǎo)致了人類歷史的第四次流感大流行，該病毒比普通季節(jié)流感病毒具備更強的傳播能力，在流行過程中病毒又由人回傳給了豬。雖然該病毒已不再呈大流行態(tài)勢，但其與其他流感病毒發(fā)

2、生基因重配可能會產(chǎn)生毒力更強的病毒，因此有必要建立準確、特異的病原學(xué)檢測方法以及可以評價不同宿主群體感染狀態(tài)的血清學(xué)診斷方法，以監(jiān)測病毒的流行和傳播規(guī)律，掌握其在不同宿主群體中的感染狀況，繼而幫助為下一次流感爆發(fā)做出預(yù)警。
　　 本研究從病原學(xué)和血清學(xué)兩個方面分別建立了病毒及血清中和抗體的檢測方法。首先利用構(gòu)建的桿狀病毒表面展示系統(tǒng)篩選到一株甲流病毒特異性的單抗，對單抗的表位進行鑒定后發(fā)現(xiàn)60KLRG63為表位的最小活性單元，同

3、時該表位不能被全病毒感染的陽性血清識別，提示表位不是HA分子的優(yōu)勢表位，其所受的免疫壓力要小于HA分子上的優(yōu)勢表位，故在病毒流行過程中不易發(fā)生變異，從而可保證單抗對病毒的有效識別；同時對抗原表位的保守性分析發(fā)現(xiàn)該表位是甲流病毒特有的，表明可以利用單抗特異地檢測甲流病毒。結(jié)合兔抗HA蛋白多抗建立了抗原捕獲ELISA方法，并對各個抗體的工作濃度進行了優(yōu)化；敏感性試驗表明所建立的方法比常規(guī)血凝試驗至少敏感8倍；特異性試驗表明用建立的方法檢測不

4、到人的季節(jié)性H1N1流感病毒及H1N1、H3N2豬流感病毒，對實驗室感染樣品的檢測發(fā)現(xiàn)該方法與雞胚病毒分離法具有較好的符合率，但不如病毒分離敏感。以上結(jié)果表明利用甲流病毒特異性的單抗建立的抗原捕獲ELISA方法可以作為甲流病毒特異性的病原學(xué)檢測的工具。
　　 將人工合成的甲流病毒A/Califorina/04/2009株HA基因連接至真核表達載體pcDNA3.1，該重組質(zhì)粒與表達逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)元件的骨架質(zhì)粒pHIT111及pHI

5、T60共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞293T，構(gòu)建了以鼠白血病病毒為核心、包裝有HA蛋白的偽型病毒。通過對偽型病毒感染細胞中報告基因表達產(chǎn)物的檢測，證明偽型病毒可成功感染MDCK及293T細胞；同時其感染過程可被重組甲流病毒免疫的小鼠的陽性血清所阻斷，表明該偽型病毒可模擬野生型病毒完成對宿主細胞的感染過程，提示該偽型病毒系統(tǒng)可作為一個特異性檢測甲流病毒中和抗體的應(yīng)用平臺，從而為準確的評價機體感染狀態(tài)或抗病毒藥物篩選、疫苗評價等提供輔助工具。同時，本

6、研究在缺少野生型病毒的條件下，利用公共數(shù)據(jù)庫所登載的目的序列構(gòu)建了與天然病毒具有相似感染特性的偽型病毒。因此理論上，其他相似的病毒表面膜蛋白也可根據(jù)本研究報道的方法構(gòu)建偽病毒系統(tǒng)，而不依賴于某種特定病原的分離、鑒定。該方法特別對于高度危險性病原研究具有一定的意義。
　　 豬在流感病毒生態(tài)中扮演著重要的角色。由于豬的呼吸道上皮細胞同時具有人流感病毒和禽流感病毒的受體，使其極有可能成為新流感病毒的產(chǎn)生源頭。控制豬流感(Swinein

7、fluenza，SI)的發(fā)生和發(fā)展有助于減少流感病毒對人類的健康威脅。疫苗免疫是預(yù)防SI的有效手段。當(dāng)前商品化的SI疫苗為包括H1和/或H3亞型病毒的滅活疫苗。與人流感疫苗不同，SI疫苗并不會按照當(dāng)年流行的優(yōu)勢毒株更換疫苗種子毒，由于流行毒株的抗原性變異，經(jīng)常導(dǎo)致現(xiàn)有商品化疫苗無法對其提供有效免疫保護的情況。鑒于此，本研究嘗試利用保守的SIV抗原組分構(gòu)建具有廣譜交叉保護效力的DNA疫苗。第一組DNA疫苗將H3亞型SIV共有的M2e及HA

8、蛋白序列的編碼基因連接至表達載體(MHa)；第二組在此基礎(chǔ)上添加一個保守的T細胞表位(MNHa)，以增強疫苗誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答的能力。通過基因槍免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，兩組DNA疫苗能有效刺激機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，同時MNHa比MHa誘導(dǎo)了更高水平的T細胞免疫應(yīng)答。攻毒保護實驗表明兩組疫苗都能夠?qū)ν碒3亞型處在不同進化譜系的病毒攻擊提供完全免疫保護，提示增強的T細胞免疫應(yīng)答對于同亞型病毒的交叉保護來講可能不是必需的；而與MHa相比，MNHa提