甲型H1N1豬流感病毒單克隆抗體的制備及夾心ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流感(swineinfluence，SI)是由豬流感病毒引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，豬流感病毒主要包括H1N1，H1N2，H3N2等亞型A型流感病毒。豬作為人流感和禽流感病毒的中間宿主，被稱為流感發(fā)生基因重排的“混合器”。豬流感的流行對(duì)感染豬群造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并具有重要的公共衛(wèi)生意義。
　　 本研究于2011年在江蘇省揚(yáng)州市某屠宰場(chǎng)采集豬鼻拭子433份和肺組織及肺門淋巴結(jié)各343份。共分離到6株豬流感病

2、毒。對(duì)分離到的6株豬流感病毒進(jìn)行HA及RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果均為病毒陽(yáng)性。
　　 同時(shí)本研究用廣東2009年流行分離株甲型H1N1流感病毒作為免疫原，免疫6～8周齡BALB/C小鼠，取其脾與SP2/0細(xì)胞融合。細(xì)胞融合后同時(shí)用ELISA、IFA及HI三種方法檢測(cè)篩選，經(jīng)過(guò)多次克隆得到8株雜交瘤細(xì)胞，分別為:2B11、1B4、2C7、3A4、6A9、6B2、3B8、6D11。其中，2B11及6D11針對(duì)的是血凝素蛋白(HA)，1

3、B4、2C7及6A9針對(duì)的是神經(jīng)氨酸酶(NA)，3A4、6B2、3B8針對(duì)的是基質(zhì)蛋白(M1)。8株單抗與分離的H1N1病毒均能產(chǎn)生不同類型的反應(yīng)，而2B11，1B4，2C7，6A9，6D11與H5、H9亞型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)、新城疫病毒(Newcastledisease，NDV)等病毒均不發(fā)生反應(yīng)。用間接免疫熒光方法檢測(cè)3A4，6B2，3B8與所有A型流感病毒均反應(yīng)，與NDV不反應(yīng)，熒光主要在

4、細(xì)胞的胞漿內(nèi)，而1B4、2B11、2C7、6A9、6D11的熒光主要在細(xì)胞膜周圍。
　　 根據(jù)把株單抗的特性，我們挑選出3A4及1B4兩株單抗建立了檢測(cè)H1N1病毒抗原的雙抗體夾心ELISA方法。首先將單抗腹水用辛酸-硫酸銨沉淀法及親和層析法進(jìn)行純化，根據(jù)兩兩配對(duì)篩選，最終選擇以1B4作為捕捉抗體，3A4作為檢測(cè)抗體。然后將3A4抗體用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記。經(jīng)過(guò)包被、封閉、二抗作用時(shí)間等條件的優(yōu)化與篩選，最終建立了特異性