膜翅目昆蟲螺原體的研究及我國部分螺原體遺傳多樣性分析.pdf

1、螺原體(spiroplasma)是一類基本形態(tài)為螺旋狀、無細胞壁的原核微生物,也是原核生物中能獨立生活和自我復制的最簡單的生命形式,它的基因組非常小(780-2220kb)。螺原體沒有細胞壁和鞭毛,僅靠單層膜包裹整個細胞,常作為研究運動的模式生物。中國有關螺原體的研究非常少,研究力量十分薄弱,調查我國昆蟲螺原體的存在情況,收集昆蟲螺原體資源,將有助于充分認識和利用這類重要的微生物資源。本研究于2009年在我國5個省,特別是南京地區(qū)采集3

2、00多種不同種類的昆蟲進行螺原體分離,結果主要在膜翅目蜜蜂總科和蛛蜂總科的昆蟲中分離到8株螺原體,分別是MUF0901分離自木蜂、STF0901和STF0902分離自四條蜂、QYF0901分離自切葉蜂、ZHUF0901分離自蛛蜂、MF0903、MF0904和MF0905均分離自蜜蜂。之后對分離菌株進行形態(tài)學、基本生物學、分子生物學及血清學特性的研究,已初步確定分離菌株的分類地位。此外,還對我國部分螺原體資源進行遺傳多樣性分析,以期調查我

3、國螺原體資源的豐富度。
　　 應用暗視野顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察螺原體形態(tài),并對分離菌株的運動性、基本生物學特性及致病性進行研究。結果發(fā)現(xiàn)分離菌株在R2液體培養(yǎng)基中都生長良好,并呈翻滾式運動,能通過孔徑為0.22μm、0.45μm的微孔濾膜；分離菌株在對數(shù)生長期都呈典型的螺旋狀；在固體培養(yǎng)基上都呈圓形或顆粒狀菌落,有些可見衛(wèi)星菌落；都能利用葡萄糖、D-果糖作為碳源；代謝精氨酸的能力稍有差異；都不能利用尿素,在含氨芐青霉素鈉(2

4、000 U/ml)的R2液體培養(yǎng)基中都生長良好；毛地黃皂苷能抑制這些菌株的生長,產生較大的抑菌圈,以上這些特征說明分離菌株均符合Spiroplasma屬的描述。在最適生長溫度下,所有菌株的生長曲線都分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個典型的生長階段,但它們的生長速度有所不同；除菌株MF0905外所有分離菌株的生長pH范圍比較寬泛,最適pH一般是7.2或7.6。經基本生物學研究發(fā)現(xiàn)分離菌株MF0905、ZHUF0901明顯區(qū)別于其它6株

5、菌。通過飼喂新鮮菌液接種法研究了2株特殊螺原體MF0905、ZHUF0901對意蜂(Apis mellifera)的致病性,發(fā)現(xiàn)感染菌株ZHUF0901的意蜂(Apis mellifera)在第6 d出現(xiàn)類似“爬蜂病”癥狀,A.mellifera校正死亡率為26.15％,與對照(接種培養(yǎng)基)相比達到5％水平顯著差異。而感染菌株MF0905的A.mellifera校正死亡率僅為2.25％,在飼喂過程中也沒有發(fā)現(xiàn)典型的“爬蜂病”癥狀,在5％

6、顯著水平下與對照(接種培養(yǎng)基)相比差異不顯著。推斷分離自蛛蜂的菌株ZHUF0901對意蜂具有較強的致病性,而分離自意蜂的菌株MF0905對意蜂的致病力較弱。
　　 采用細菌試劑盒提取螺原體DNA,然后對16S rDNA、ITS、rpoB、parE、spiralin等5個基因進行PCR擴增并測序,之后結合其它已報道的螺原體屬內所有的種進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果表明spiralin基因可能不適合作為一個遺傳marker在種水平上進行螺原

7、體分類鑒定；基于16S rDNA、ITS、rpoB、parE等序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示:ZHUF0901與S.apis聚為一枝；MF0905與S.clarkii聚成一類；其它6株菌都與Spiroplasma melliferum聚類,它們的自展值都很高,因此推斷ZHUF0901可能是S.apis,MF0905可能是S.clarkii,其它6株菌STF0901、OYF0901、MUF0901、MF0903、STF0902、MF0904都屬

8、于S.melliferum,但需要用血清學試驗進一步證明。
　　 通過免疫新西蘭大白兔獲得了ZHUF0901、MF0905多克隆抗體,利用實驗室已有的抗體及新制備的抗體,對分離的8株螺原體分別進行了生長抑制試驗、代謝抑制試驗、菌體變形試驗。3個血清學試驗結果一致表明:在用已知的S.melliferum抗體與分離菌株反應時,ZHUF0901、MF0905表現(xiàn)弱反應,而其它6株菌則表現(xiàn)較強的反應；在用ZHUF0901、MF0905抗

9、體進行交叉互補試驗時,這2株螺原體都只分別與自身的抗體表現(xiàn)較強的特異性反應并產生較大的抑菌圈,而與其它菌株的抗體反應較弱。以上結果表明,菌株MUF0901、STF0901、STF0902、OYF0901、MF0903、MF0904與S.melliferum親緣關系較近,屬于S.melliferum類群,而ZHUF0901、MF0905不屬于 S.melliferum。
　　 蜜蜂螺原體是蜜蜂螺原體病(spiroplasmosis

10、)的致病菌,也是蜜蜂爬蜂病的主要病原之一。本研究以蜜蜂螺原體標準菌株S.melliferum CH-1作為包被抗原,建立了S.melliferum CH-1的間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)檢測方法。利用建立的ELISA標準化程序對分離菌株進行了分類鑒定,結果顯示ELISA方法與上述傳統(tǒng)的血清學方法所得結果一致,而且結果更加準確、具體。此方法的建立也為今后蜜蜂螺原體快速檢測技術的實際應用奠定了基礎。
　　 采用隨機擴增多態(tài)DN

11、A(RAPD)技術,對實驗室20株昆蟲及植物花螺原體的分類、宿主種類、菌株之間的遺傳多樣性進行了分析。從40條隨機引物中篩選出34條引物,共擴增出5301條條帶,其中4954條表現(xiàn)出多態(tài)性,多態(tài)性條帶占93.45％。根據螺原體個體間的相似性,用UPGMA法聚類分析。結果表明,分離菌株在60％相似性水平上可聚類分為5個分枝,其中A1分枝包括5個菌株,除1株分離自昆蟲外其余4株都分離自植物花；A3分枝主要包括的是膜翅目昆蟲螺原體；A4分枝包

12、括了3個目的昆蟲螺原體；B、C都僅包括一個菌株。以上結果初步說明我國螺原體的遺傳多樣性豐富。
　　 本研究通過對8株昆蟲螺原體進行形態(tài)學、基本生物學、分子生物學以及血清學特性等方面的研究。初步推斷分離自蛛蜂的ZHUF0901可能是Spiroplasma apis,分離自蜜蜂的MF0905可能是Spiroplasma clarkii,其它6株菌屬于Spiroplasma melliferum。這是首次在我國發(fā)現(xiàn)S.apis,也是首